池曉峰，姜宏，楊東

吉林省腫瘤醫(yī)院骨及軟組織腫瘤外科，長春 130000

骨肉瘤是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，源自原始的骨形成間充質(zhì)細胞，主要發(fā)生在骨骼生長和修復(fù)迅速的區(qū)域周圍，如膝關(guān)節(jié)、股骨下骨和上脛骨[1]。順鉑（cisplatin，DDP）是骨肉瘤患者的常用化療藥物之一，具有廣譜的抗腫瘤活性，但臨床上初始化療緩解后產(chǎn)生的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象嚴重影響其治療效果[2-3]。分化抑制因子（inhibitors of differentiation，ID）在生物體中廣泛表達，并且在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達的趨勢[4]。ID3是ID蛋白家族的重要成員之一，其表達具有細胞類型的特異性[5-7]。據(jù)相關(guān)文獻報道，ID3的表達差異與前列腺癌[5]、肺腺癌[6]以及卵巢癌[7]等多種腫瘤相關(guān)，然而，其在骨肉瘤中的作用機制及骨肉瘤細胞的順鉑耐藥性方面尚不明確。本研究首先篩選了骨肉瘤順鉑耐藥株；其次運用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和 Western blot方法，檢測了ID3基因與順鉑耐藥的關(guān)系；最后通過細胞毒性實驗與凋亡檢測，輔以ID3基因過表達的手段，探討了ID3基因過表達對骨肉瘤細胞順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，以期為骨肉瘤順鉑耐藥性的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人骨肉瘤細胞株U-2 OS購自美國ATCC公司；DDP購自Sigma公司；CCK8試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；人ID3基因過表達載體及其陰性對照載體購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；ID3、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、Caspase-3、RhoE和人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自Abcam公司。

1.2 順鉑耐藥細胞株的篩選

以DDP為誘導(dǎo)劑，對人骨肉瘤細胞株U-2 OS采用大劑量沖擊與逐步增加劑量相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)建立順鉑耐藥細胞系U-2 OS/DDP。U-2 OS/DDP和U-2 OS細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞毒性實驗

取對數(shù)生長期內(nèi)U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞，以每孔3×104/ml接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度DDP（0、0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml）進行細胞分組處理，實驗過程中每組數(shù)據(jù)設(shè)置3個復(fù)孔作為平行實驗，并采用CCK8方法檢測U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞的生長抑制作用，并計算其半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥指數(shù)（resistant index，RI）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測ID3基因的表達

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞中ID3的mRNA表達水平。采用TRIzol方法提取細胞的總RNA。總RNA用DNase除去殘留的基因組DNA后，使用具有隨機引物的逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）進行逆轉(zhuǎn)錄。使用以下引物將得到的cDNA用作ABI 7500儀器上的PCR擴增的模板，人ID3正向引物：5'-ATGAAGGCGCTGAGCCCGGTGC-3'，反向引物：5'-ACGGCCGAGTCAGTGGCAAAAGC-3'；GAPDH正向引物：5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'，反向引物：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。實驗過程中每組數(shù)據(jù)設(shè)置3個復(fù)孔作為平行實驗，GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.5 Western blot檢測ID3蛋白表達

采用Western blot法檢測U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞中ID3蛋白的表達水平。常規(guī)方法提取細胞總蛋白后，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠來分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維過濾膜（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，5%脫脂奶粉封閉后，使用一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（ID3、P-gp、Caspase-3和RhoE）孵育，隨后進行增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）顯影。采用Image J分析軟件進行灰度值定量分析，并將ID3與GAPDH的灰度比值作為ID3蛋白的相對表達量，實驗過程中每組數(shù)據(jù)設(shè)置3個復(fù)孔作為平行實驗。

1.6 ID3基因過表達對骨肉瘤細胞順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

人ID3基因過表達載體及其陰性對照載體購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，并通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將ID3基因過表達載體及其陰性對照載體導(dǎo)入U-2 OS細胞和U-2 OS/DDP細胞。不同濃度DDP（0、0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml）處理U-2 OS/DDP細胞后，采用CCK8方法再次檢測各組細胞的生長抑制率；同時，選取0、1、2 μg/ml的轉(zhuǎn)染組細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用Annexin V-FITC和PI雙重染色法結(jié)合流式細胞術(shù)，評估經(jīng)歷凋亡的細胞百分比。實驗過程中每組數(shù)據(jù)設(shè)置3個復(fù)孔作為平行實驗。Annexin V陽性和PI陰性染色的細胞是早期凋亡細胞，而具有Annexin V和PI陽性染色的細胞處于細胞凋亡的晚期階段。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，采用Pearson相關(guān)分析法進行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑處理對骨肉瘤細胞生長功能的影響

不同濃度的順鉑藥物作用于親本細胞株U-2 OS和順鉑耐藥株U-2 OS/DDP細胞24 h后，隨著順鉑濃度（0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml）的增加，細胞株 U-2 OS（r2=0.885，P=0.004）及 U-2 OS/DDP（r2=0.970，P﹤0.001）的生長抑制率亦隨之升高，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，詳見表1。DDP對U-2 OS細胞的 IC50為 6.58 μg/ml，對U-2 OS/DDP細胞的 IC50為 19.89 μg/ml，U-2 OS/DDP 細胞對 DDP 的耐藥指數(shù)（RI）為3.02。

2.2 骨肉瘤細胞中ID3基因的mRNA表達

qRT-PCR檢測U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中ID3基因的mRNA表達水平差異。結(jié)果顯示，U-2 OS細胞中ID3基因的mRNA表達水平為（0.85±0.04），明顯高于U-2 OS/DDP細胞的（0.31±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（t=16.534，P﹤0.001）。（圖1）

表1 不同濃度的DDP對U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞生長抑制率的影響（%，±s）

表1 不同濃度的DDP對U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞生長抑制率的影響（%，±s）

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圖1 qRT-PCR法檢測U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中ID3基因的mRNA表達

2.3 骨肉瘤細胞中ID3蛋白的表達

Western blot法檢測ID3蛋白在U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中的表達差異。結(jié)果顯示，U-2 OS細胞中ID3蛋白的表達水平為（0.30±0.03），明顯高于U-2 OS/DDP細胞的（0.14±0.03），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.532，P﹤0.001）。（圖2）

圖2 U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中ID3蛋白表達情況

2.4 ID3基因過表達對骨肉瘤細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

U-2 OS/DDP細胞轉(zhuǎn)染ID3過表達載體和陰性對照載體后，分別加入不同濃度DDP（0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml），ID3過表達耐藥株U-2 OS/DDP細胞（ID3+組）與陰性對照耐藥株U-2 OS/DDP細胞（對照組）的生長抑制率情況詳見表2。與對照組比較，加入DDP后ID3+組U-2 OS/DDP細胞的抑制率明顯上升，DDP耐藥性明顯下降（r2=0.936，P﹤0.001），細胞的IC50下降至 9.83 μg/ml，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.02倍。

2.5 ID3基因表達對U-2 OS/DDP凋亡的影響

U-2 OS/DDP細胞轉(zhuǎn)染ID3過表達載體和陰性對照載體后，分別加入不同濃度DDP（0、1、2 μg/ml），流式細胞儀Annexin V-FITC和PI雙染法測定細胞凋亡率，詳見圖3。與對照組比較，ID3+組U-2 OS/DDP細胞凋亡率提高（P﹤0.05）；隨著DDP濃度的增高，對照組和ID3+組的早期凋亡細胞所占百分比均隨之增加。

表2 ID3基因過表達對U-2 OS/DDP細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（%，±s）

表2 ID3基因過表達對U-2 OS/DDP細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（%，±s）

生長抑制率DDP（μg/ml）0.5 151 0 15 20 30 40 ID3+組21.86±0.23 26.54±1.63 42.64±2.65 51.29±2.75 60.72±4.28 71.35±0.21 76.81±3.23 80.92±3.54對照組5.68±1.02 8.82±0.95 18.28±1.67 29.36±3.66 36.35±2.84 46.52±1.56 51.63±4.87 57.55±0.42

圖3 不同濃度DDP作用下ID3基因表達對U-2 OS/DDP細胞凋亡的影響

2.6 Western blot法檢測ID3基因過表達對P-gp、RhoE和Caspase-3表達的影響

為了進一步探討ID3基因?qū)-2 OS/DDP順鉑耐藥性的影響，本研究采用了Western blot法檢測U-2 OS/DDP細胞中P-gp、RhoE和Caspase-3的表達情況，檢測結(jié)果詳見圖4。對照組RhoE、Caspase-3、P-gp蛋白表達分別為（0.148±0.005）、（0.196±0.012）、（0.662±0.013），與對照組比較，ID3+組上調(diào)了RhoE（0.325±0.003，t=57.31，P﹤0.05）和Caspase-3蛋白的表達水平（0.797±0.024，t=38.37，P﹤0.05），但卻下調(diào)了P-gp蛋白的表達水平（0.159±0.004，t=63.50，P﹤0.05）。

圖4 ID3過表達對U-2 OS/DDP細胞中P-gp、RhoE和Caspase-3表達的影響

3 討論

ID3是一種螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉(zhuǎn)錄因子，負責調(diào)控堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH），進而抑制細胞分化、促進細胞增殖[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，ID3在生物體中起著致癌的作用，并且在不同的惡性腫瘤中有表達差異[5-7]。ID3對腫瘤的正向調(diào)節(jié)作用，使其有望成為腫瘤治療的新靶點。順鉑具有抗癌活性，是癌癥治療的重要化療藥物，但由于腫瘤細胞產(chǎn)生的耐藥性，使得順鉑藥物的治療達到了瓶頸。有研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的ID3基因的過表達效應(yīng)可以抑制肺癌細胞A549的細胞增殖，促進其凋亡[6,9]。Koyama等[10]用CDDP誘導(dǎo)骨肉瘤細胞MG63時發(fā)現(xiàn)，CDDP誘導(dǎo)的細胞凋亡與ID3基因的短暫上調(diào)有關(guān)。本研究中，篩選了U-2 OS細胞的順鉑耐藥株（U-2 OS/DDP），并對親本株U-2 OS和耐藥株U-2 OS/DDP中的ID3mRNA水平和蛋白水平進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐藥株U-2 OS/DDP中ID3的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均明顯低于親本株的U-2 OS。

腫瘤耐藥株中，凋亡抑制基因的表達增加，同時伴隨著細胞增殖能力的增強以及凋亡能力的減弱。Koyama等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，ID3基因過表達的骨肉瘤細胞MG63中，CDDP的誘導(dǎo)可增強ROS效應(yīng)和Caspase-3的活性。Trougakos等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ID3基因高表達的骨肉瘤細胞中，與細胞增殖相關(guān)的PCNA反而低表達。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ID3基因的表達強度與A549細胞的順鉑耐藥性有關(guān)，ID3基因的過表達可以逆轉(zhuǎn)耐藥株的順鉑耐藥性。本研究為探究ID3基因在骨肉瘤順鉑耐藥株U-2 OS/DDP中的耐藥作用，先后對U-2 OS和U-2 OS/DDP、陰性對照耐藥株（對照）和ID3基因過表達耐藥株（ID3+）受不同濃度的順鉑作用后的細胞增殖活性進行了檢測，結(jié)果顯示，DDP對U-2 OS細胞的IC50為6.58 μg/ml，對U-2 OS/DDP細胞的IC50為19.89 μg/ml，U-2 OS/DDP細胞對DDP的耐藥指數(shù)（RI）為3.02。與對照組比較，加入順鉑后ID3+組U-2 OS/DDP細胞的抑制率明顯上升，順鉑耐藥性明顯下降，這表明ID3基因過表達對骨肉瘤細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。值得注意的是，DDP在5 μg/ml時即可明顯抑制親本U-2 OS細胞的增殖，對順鉑耐藥株U-2 OS/DDP也有一定程度的抑制作用，但在DDP的濃度達到20 μg/ml左右時，U-2 OS/DDP細胞的增殖抑制率才能達到相應(yīng)的效果。同時，順鉑耐藥細胞株U-2 OS/DDP的RI達到3.0以上，說明U-2 OS/DDP耐藥株持有較好的耐藥特性，達到后續(xù)實驗的要求。ID3基因過表達后，DDP對U-2 OS/DDP細胞的IC50降至 9.83 μg/ml，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為 2.02 倍。隨后，本研究又對對照組耐藥株和ID3+組耐藥株中的細胞凋亡情況進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ID3+組細胞的凋亡率高于對照組，且隨著DDP濃度的增加，早期凋亡細胞所占百分比亦隨之增加。結(jié)合U-2 OS和U-2 OS/DDP細胞中ID3基因和蛋白的表達水平差異，推測ID3基因的表達降低骨肉瘤細胞的順鉑耐藥性，其過表達效應(yīng)可以逆轉(zhuǎn)U-2 OS/DDP細胞對順鉑的耐藥性。此結(jié)果進一步證明，ID3基因在骨肉瘤細胞順鉑耐藥機制中起到關(guān)鍵作用。

MDR現(xiàn)象的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。P-gp由MDR1基因編碼，可與藥物結(jié)合，隨后將藥物排出體外，從而降低胞內(nèi)藥物濃度，即產(chǎn)生耐藥性[12]。P-gp的表達高低與腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度呈負相關(guān)[13]。RhoE是RhoGTPase家族成員之一，在肺癌細胞中表達下調(diào)，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]，而RhoE的上調(diào)表達，則可能起到抑制腫瘤的作用[15]。腫瘤細胞的耐藥性與細胞凋亡呈負相關(guān)，Caspase-3作為細胞凋亡的執(zhí)行者，與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)[16]。本研究采用Western blot法對ID3+耐藥株和對照耐藥株中的P-gp、RhoE和Caspase-3的蛋白水平表達進行了檢測。結(jié)果顯示，ID3過表達后，P-gp蛋白水平下降，RhoE和Caspase-3的蛋白水平上升，此結(jié)果進一步體現(xiàn)出ID3基因在骨肉瘤細胞順鉑耐藥中的逆轉(zhuǎn)作用。

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