王俊鋼，楊麗，田君娜，張潔

南陽市中心醫(yī)院胸外科，河南 南陽 473009

食管癌是一種常見的食管腫瘤，約占全部食管腫瘤的90%。食管癌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，據(jù)統(tǒng)計世界范圍內(nèi)每年約有超過20萬人死于食管癌[1]。癌細(xì)胞的能量代謝方式與正常細(xì)胞不同，正常細(xì)胞在有氧條件下以有氧氧化為主，只有在供氧不足時才會啟動糖酵解途徑供能，而癌細(xì)胞無論是在有氧條件還是在缺氧條件下均優(yōu)先以糖酵解途徑供能，癌細(xì)胞的這種能量代謝方式使其在缺氧條件下具有更強的耐受能力[2]。原花青素具有抗氧化、消除氧自由基、消炎、抗過敏、抗心律失常等作用，廣泛存在于植物木實部以及果實的皮中[3]。有研究表明，原花青素能夠抑制胃癌、胰腺癌、卵巢癌等多種癌細(xì)胞的增殖，抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。為了明確原花青素對食管癌細(xì)胞增殖和糖酵解的影響，本研究采用MTT、Western blot等多種實驗方法對原花青素的作用及機制進(jìn)行探討，以期為原花青素治療食管癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

食管癌細(xì)胞株OE33、CP-C、Eca109均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；乳酸含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性檢測試劑盒、己糖激酶（hexokinase，HK）活性檢測試劑盒均購自美國Cayman公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Akt單克隆抗體、p-Akt單克隆抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）單克隆抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）單克隆抗體均購自美國Santacruze公司；牛血清白蛋白購自上海博谷生物科技有限公司；原花青素（提取自葡萄籽中）購自西安天行健生物制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮中的人食管癌細(xì)胞株OE33、CP-C、Eca109，置于37 ℃環(huán)境下，使細(xì)胞在1 min內(nèi)融化，加入RPMI1640培養(yǎng)基混合后，1000 r/min離心10 min，棄上清，用含有10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 2次，1000 r/min離心 10 min，棄上清液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化溫度為37℃，觀察細(xì)胞呈單個存在時，轉(zhuǎn)移至離心管中1000 r/min離心10 min，棄酶蛋白酶消化液，用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按照實驗要求按不同比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的食管癌細(xì)胞株OE33、CP-C、Eca109，胰蛋白酶消化后，離心，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按照每孔加入3000個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。觀察細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成含有0、60、120、180、240、300 μmol/L原花青素的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時以不加入細(xì)胞的組為空白組，每個濃度梯度設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，在每孔中加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），在37 ℃孵育反應(yīng)4 h后，吸除上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜溶液，在搖床室溫環(huán)境下緩慢振蕩8 min，觀察結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測各組的光密度值（optical density，OD），計算細(xì)胞存活率，以0 μmol/L原花青素作用組為對照。細(xì)胞存活率=[（原花青素作用組OD值-空白OD值）/（對照OD值-空白OD值）]×100%。

1.3.3 ATP含量檢測 用半數(shù)抑制濃度的原花青素作用于人食管癌細(xì)胞株Eca109 48 h后，棄上清液，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用生理鹽水反復(fù)洗滌細(xì)胞，加入超純水懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸浮液。用勻漿器勻漿后，轉(zhuǎn)移到EP管中，于100℃的水浴鍋中孵育10 min。按照ATP檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞中ATP的含量。

1.3.4 乳酸含量檢測 用半數(shù)抑制濃度的原花青素作用于人食管癌細(xì)胞株Eca109 48 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，根據(jù)乳酸含量檢測試劑盒說明書檢測上清液中的乳酸含量。

1.3.5 丙酮酸激酶和己糖激酶活性檢測 用半數(shù)抑制濃度的原花青素作用于人食管癌細(xì)胞株Eca109 48 h后，用丙酮酸激酶活性檢測試劑盒和己糖激酶活性檢測試劑盒分別檢測并計算細(xì)胞中丙酮酸激酶和己糖激酶的活性。

1.3.6 Western blot法檢測 Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3水平 采用半數(shù)抑制濃度的原花青素作用于Eca109細(xì)胞株細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。取出蛋白樣品與2×Loading buffer按照1∶1的比例混合均勻，于100℃煮沸5 min使蛋白變性。按照每孔加入40 μl變性蛋白樣品加入到聚丙烯酰氨凝膠（8%分離膠，5%濃縮膠）電泳上樣孔中。在45 mV恒流條件下電泳。取出蛋白凝膠，在4℃，25 mV恒流條件下轉(zhuǎn)膜90 min。用5%牛血清白蛋白在37℃封閉60 min。800倍稀釋一抗，4℃反應(yīng)過夜；1000倍稀釋二抗，37℃反應(yīng)90 min，滴加顯色液，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為 內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，組間比較采用t檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

60、120、180、240、300 μmol/L原花青素作用后，OE33、CP-C、Eca109細(xì)胞的細(xì)胞存活率均較0 μmol/L組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。隨著原花青素作用濃度的升高，OE33、CP-C、Eca109細(xì)胞的細(xì)胞存活率均下降（P﹤0.05）。OE33、CP-C、Eca109細(xì)胞的原花青素半數(shù)抑制濃度分別為（285.48±3.58）μmol/L、（291.00±3.36）μmol/L、（237.95±4.91）μmol/L。原花青素對Eca109細(xì)胞的抑制作用最大，后續(xù)選用240 μmol/L原花青素作用于Eca109細(xì)胞繼續(xù)研究。（表1）

表1 不同濃度原花青素作用于人食管癌細(xì)胞株后的細(xì)胞存活率（%，±s）

表1 不同濃度原花青素作用于人食管癌細(xì)胞株后的細(xì)胞存活率（%，±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05；b與60 μmol/L組比較，P<0.05；c與120 μmol/L組比較，P<0.05；d與180 μmol/L組比較，P<0.05；e與240 μmol/L組比較，P<0.05

原花青素濃度（μmol/L）0（n=3）60（n=3）120（n=3）180（n=3）240（n=3）300（n=3）人食管癌細(xì)胞OE33 100.05±3.23 92.84±5.93a 85.36±4.90ab 69.18±5.37abc 58.63±5.57abcd 44.85±5.81abcde CP-C 100.06±6.92 94.25±4.52a 86.15±6.31ab 72.31±3.54abc 63.17±2.87abcd 46.84±3.82abcde Eca109 100.00±3.65 92.31±6.52a 83.64±4.65ab 66.15±8.64abc 48.25±3.61abcd 40.85±4.69abcde

2.2 ATP及乳酸含量檢測結(jié)果

240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細(xì)胞中的ATP及乳酸含量均較0 μmol/L組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 不同濃度原花青素作用后Eca109細(xì)胞中ATP及乳酸含量的比較（mmol/L，±s）

表2 不同濃度原花青素作用后Eca109細(xì)胞中ATP及乳酸含量的比較（mmol/L，±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05

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2.3 丙酮酸激酶及己糖激酶活性檢測結(jié)果

240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細(xì)胞的丙酮酸激酶及己糖激酶活性均較與0 μmol/L組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 不同濃度原花青素作用后Eca109細(xì)胞中丙酮酸激酶及己糖激酶活性的比較（U/mg，±s）

表3 不同濃度原花青素作用后Eca109細(xì)胞中丙酮酸激酶及己糖激酶活性的比較（U/mg，±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05

原花青素濃度（μmol/L）0（n=3）240（n=3）t值P值丙酮酸激酶0.86±0.06 0.41±0.03a 11.619 0.000己糖激酶5.36±0.06 3.21±0.02a 58.880 0.000

2.4 Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3表達(dá)水平檢測結(jié)果

240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細(xì)胞中的 Akt、STAT3水平與 0 μmol/L 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細(xì)胞中的p-Akt、p-STAT3水平均較0 μmol/L組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖1）

圖1 不同濃度原花青素作用后Eca109細(xì)胞中Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平

3 討論

原花青素是一類多酚化合物的總稱，有二聚體、三聚體等多種形式。最初的研究表明，原花青素可以與多種蛋白質(zhì)或消化酶結(jié)合形成化合物調(diào)控食物的吸收過程，隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)原花青素還具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎等多種藥理學(xué)作用[6-7]。Ma等[8]研究表明，原花青素可以抑制胰腺癌細(xì)胞AsPC-1的增殖、遷移和侵襲過程。潘曉婧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可以增加宮頸癌細(xì)胞HeLa的重離子輻射敏感性。Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn)，100～300 μg/ml的原花青素能夠呈濃度和時間依賴的抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖。以上研究結(jié)果均表明，原花青素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的原花青素對三株食管癌細(xì)胞均具有增殖抑制作用，并且增殖抑制作用隨著原花青素作用濃度的增加而增加，這與之前的研究報道一致，均說明原花青素具有抗腫瘤的作用。

腫瘤細(xì)胞的能量代謝途徑與正常細(xì)胞不同，無論是在缺氧還是氧氣充足的情況下均以糖酵解途徑供能[11]。在糖酵解過程中有多種限速酶，例如己糖激酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、丙酮酸激酶等，這些酶的活性高低直接影響糖酵解途徑[12]。乳酸是糖酵解途徑的產(chǎn)物，糖酵解增加時，乳酸含量升高[13]。Zhao等[14]研究表明，miRNA-181b能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解，而干擾miRNA-181b表達(dá)后結(jié)腸癌有氧糖酵解被抑制。王秀等[15]研究表明，通過干擾原癌基因垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因能夠降低卵巢癌細(xì)胞中的己糖激酶活性，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。Di等[16]研究表明，脯氨酸羥化酶 2（PHD2）下調(diào)后，結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T乳酸分泌水平和ATP水平明顯升高。本研究結(jié)果表明，原花青素作用后食管癌細(xì)胞中己糖激酶、丙酮酸激酶活性降低，ATP含量降低，細(xì)胞分泌的乳酸減少，說明原花青素能夠抑制食管癌細(xì)胞的糖酵解途徑。

癌細(xì)胞的生長和能量代謝是一個極為復(fù)雜的過程，是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的最終結(jié)果。Akt信號通路和STAT3信號通路在腫瘤中異常激活，其磷酸化水平異常升高，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和能量代謝過程[17]。Yu等[18]研究表明，抑制Akt信號通路能夠抑制缺氧環(huán)境和常氧環(huán)境下食管癌細(xì)胞中糖酵解酶的活性，降低培養(yǎng)液上清中乳酸含量，抑制食管癌細(xì)胞糖酵解途徑。潘曉林[19]的研究表明，miRNA-181b可以通過影響STAT3磷酸化水平干擾結(jié)腸癌細(xì)胞能量代謝。本研究結(jié)果顯示，原花青素能夠降低食管癌細(xì)胞中Akt磷酸化水平和STAT3磷酸化水平，提示原花青素可能通過作用于Akt信號通路和STAT3信號通路影響食管癌細(xì)胞的增殖和糖酵解。

綜上所述，原花青素可能通過抑制Akt信號通路和STAT3信號通路的激活抑制食管癌細(xì)胞增殖，干擾食管癌細(xì)胞糖酵解。本研究只在體外進(jìn)行了細(xì)胞實驗，后續(xù)會在體內(nèi)進(jìn)一步研究其作用機制。本研究為進(jìn)一步探討原花青素的抗腫瘤作用機制奠定了基礎(chǔ)，為原花青素治療腫瘤提供了理論基礎(chǔ)。

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