趙軒宇,焦思萌,宋丹,陳嬌,商若天,張強(qiáng),劉思迪,孔為民#,韓東
1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科,北京 100006
2國(guó)家納米科學(xué)中心,北京 100190
宮頸癌是威脅女性生命健康的主要疾病。目前宮頸癌的研究主要集中于癌細(xì)胞本身,而對(duì)其生存環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用鮮有研究。從腫瘤微環(huán)境角度出發(fā),通過(guò)改變某些環(huán)境因素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或提高現(xiàn)有治療方法的效果,或許可以為宮頸癌治療提供新的思路。臨床工作中大部分宮頸癌組織質(zhì)地較硬,提示宮頸癌細(xì)胞及其微環(huán)境成分與正常組織不同,這種差異可以通過(guò)某些微納力學(xué)參數(shù)綜合體現(xiàn),如流體靜力壓、剪切力、壓縮力和張力等[1],剛度是一項(xiàng)重要的參數(shù),參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、活化、分化和遷移等過(guò)程[2-4]。本研究通過(guò)模擬不同組織器官的基底剛度,觀察HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
1.1.1 細(xì)胞株 宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection,ATCC)。
1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(澳洲血源)購(gòu)于美國(guó)GIBCO/Invitrogen公司;CCK-8細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本Dojindo公司;4’,6二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(rhodamine phalloidin)、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 488)單克隆抗體、小鼠抗人微管蛋白單克隆抗體(mouse anti-alpha tubulin monoclonal antibody)均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。
1.1.3 不同基底剛度培養(yǎng)皿 采用多聚水凝膠聚丙烯酰胺(polyacrylamide)模擬不同組織的基底剛度。0.5、5.0、25.0 kPa分別模擬淋巴結(jié)、肺臟和正常宮頸組織的基底剛度,以普通塑料/玻璃培養(yǎng)皿作為對(duì)照,其基底剛度約為1.0×106kPa??煽貏偠榷嗑鬯z培養(yǎng)皿購(gòu)于北京德潤(rùn)豐科技有限責(zé)任公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和L-谷氨酰胺的DEME培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞。
1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8法)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞,按照10 000/cm2的密度分別接種于0.5、5.0、25.0、1.0×106kPa(塑料基底)的24孔板中,每天細(xì)胞換半液,細(xì)胞培養(yǎng)3 d,每天采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性(加入10%培養(yǎng)基總體積的CCK-8溶液,37℃、5%CO2條件下孵育3 h,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度值),并繪制生存曲線,計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間,計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[5],Td=t×log2/(logNt-logN0),其中Td為細(xì)胞倍增時(shí)間,t為培養(yǎng)時(shí)間,N0為細(xì)胞接種數(shù),Nt為培養(yǎng)t小時(shí)后總細(xì)胞數(shù)量。
1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)差異 宮頸癌HeLa細(xì)胞以10 000/cm2的密度接種于厚度為35 mm的不同基底剛度和塑料基底的培養(yǎng)皿上,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡20倍和40倍下觀察細(xì)胞形態(tài),每個(gè)培養(yǎng)基隨機(jī)留取3個(gè)視野圖片。
1.2.4 環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)差異 宮頸癌HeLa細(xì)胞以10 000/cm2的密度接種于不同基底剛度和普通細(xì)胞爬片上,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h,固定,乙醇梯度脫水后,利用CO2臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥;利用環(huán)境掃描電子顯微鏡的低真空模式,觀察不同基底剛度上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞成像。
1.2.5 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的骨架差異細(xì)胞遷移等行為與細(xì)胞骨架息息相關(guān),為了觀察基底剛度對(duì)HeLa細(xì)胞骨架裝配的影響,用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架蛋白F-actin進(jìn)行染色,DAPI對(duì)細(xì)胞核染色,用抗微管蛋白單克隆抗體和Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗對(duì)微管蛋白進(jìn)行染色。在單光子激光共聚焦顯微鏡40倍物鏡下進(jìn)行觀察。成像中細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后呈藍(lán)色,微管蛋白(α-Tublin)經(jīng)染色后呈綠色,肌動(dòng)蛋白經(jīng)染色后呈紅色。
采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均值比較采用單因素方差分析。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
HeLa細(xì)胞在不同基底剛度上培養(yǎng)48 h后,其鋪展和形態(tài)基本穩(wěn)定。將細(xì)胞移至倒置顯微鏡(20倍物鏡)下,細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)和細(xì)胞形態(tài)顯示,0.5 kPa水凝膠培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞不能完全鋪展,大部分的細(xì)胞形態(tài)呈圓形,細(xì)胞貼壁不牢,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基部分,細(xì)胞可晃動(dòng);隨著基底剛度增加,細(xì)胞鋪展面積逐漸增加,細(xì)胞貼壁愈加牢固,細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或梭形,詳見圖1。采用Image J 2.1.4.7圖像處理軟件測(cè)量不同基底剛度上培養(yǎng)的細(xì)胞的最長(zhǎng)直徑/最短直徑以及細(xì)胞鋪展面積,數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析后顯示,不同基底剛度組的最長(zhǎng)直徑/最短直徑、細(xì)胞鋪展面積比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.54、77.21,P﹤0.01),詳見表1。
圖1 倒置顯微鏡下不同基底剛度上培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞形態(tài)(×20)
表1 不同基底剛度上培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞的最長(zhǎng)直徑/最短直徑、細(xì)胞鋪展面積情況(±s)
表1 不同基底剛度上培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞的最長(zhǎng)直徑/最短直徑、細(xì)胞鋪展面積情況(±s)
基底剛度(kPa)0.5(n=13)5.0(n=13)25.0(n=9)最長(zhǎng)直徑/最短直徑1.07±0.04 1.78±0.44 2.41±0.87細(xì)胞鋪展面積(μm2)38.12±9.12 46.18±7.41 68.36±22.54 1.0×106(n=9)3.44±1.53 186.11±47.85
HeLa細(xì)胞在不同基底剛度上培養(yǎng)48 h,環(huán)境掃描電子顯微鏡的低真空模式下不同基底剛度上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞成像顯示,0.5 kPa水凝膠培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞的鋪展情況最差,細(xì)胞呈圓形,細(xì)胞周圍可見少量的絲狀偽足,細(xì)胞偽足稀疏且短??;5.0 kPa水凝膠培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞的鋪展情況稍好于0.5 kPa,細(xì)胞多呈梭形或類圓形,細(xì)胞周圍可見絲狀偽足,細(xì)胞偽足稀疏且短?。?5.0 kPa水凝膠培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞呈不規(guī)則形狀鋪展,細(xì)胞周圍可見片狀偽足和絲狀偽足,細(xì)胞偽足比較細(xì)?。?.0×106kPa普通塑料培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞鋪展情況最好,細(xì)胞多呈片狀,細(xì)胞周圍可見帶狀偽足和絲狀偽足,細(xì)胞偽足豐富且纖長(zhǎng)。(圖2)
圖2 環(huán)境掃描電子顯微鏡下不同基底剛度上培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)
單光子激光共聚焦顯微鏡對(duì)不同基底剛度上HeLa細(xì)胞骨架成像顯示,0.5 kPa水凝膠基底上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞,其肌動(dòng)蛋白和微管蛋白彌散分布在細(xì)胞質(zhì)中,隨著基底剛度增加,細(xì)胞骨架逐漸成型,細(xì)胞發(fā)生極化現(xiàn)象;5.0 kPa水凝膠基底上,HeLa細(xì)胞已發(fā)現(xiàn)具有方向性纖維束(應(yīng)力纖維);25.0 kPa水凝膠基底和1.0×106kPa玻璃基底上,應(yīng)力纖維逐漸變粗變長(zhǎng),相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀,其方向與細(xì)胞長(zhǎng)軸基本平行。(圖3)
圖3 免疫熒光法檢測(cè)HeLa細(xì)胞在不同剛度基底上細(xì)胞骨架纖維的裝配差異(×40)
采用CCK-8法,每天檢測(cè)不同基底剛度上培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞的活性,根據(jù)光密度值繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線后顯示,較大基底剛度上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞比小基底剛度上HeLa細(xì)胞先進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,詳見圖4A。以48 h培養(yǎng)為基礎(chǔ)計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間后顯示,0.5、5.0、25.0、1.0×106kPa基底剛度上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞,其倍增時(shí)間分別為60.40、39.43、27.79、26.34 h,細(xì)胞倍增時(shí)間隨著基底剛度的增加而縮短,詳見圖4B。
圖4 不同基底剛度上HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和倍增時(shí)間
剛度是物理學(xué)中的概念,描述材料或結(jié)構(gòu)在受力時(shí)抵抗彈性變形能力的強(qiáng)弱,也可以描述生物組織的力學(xué)性質(zhì),是微納力學(xué)的重要參數(shù)。生物組織的剛度可以通過(guò)原子力顯微鏡或壓痕儀進(jìn)行測(cè)定[6]。Leventa等[7]采用不同方法測(cè)量部分組織剛度,結(jié)果顯示不同組織的剛度不盡相同,而且相同組織的不同狀態(tài),如纖維化和癌變等,剛度存在很大的差異。同樣,宮頸組織在不同的生理病理狀態(tài)下,其剛度不斷變化,如妊娠狀態(tài)下隨著孕周的增加,宮頸組織的剛度趨于減小[8];隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的增加,宮頸組織的剛度逐漸增加[9]。剛度不僅參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和遷移等過(guò)程,還與宮頸的病理生理狀態(tài)息息相關(guān)。國(guó)內(nèi)鮮有學(xué)者研究細(xì)胞生存環(huán)境剛度的變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,所以本研究模擬常見的宮頸癌轉(zhuǎn)移器官的剛度,即0.5、5.0、25.0 kPa,分別模擬淋巴結(jié)、肺臟和正常宮頸組織的基底剛度[7],研究不同基底剛度上HeLa細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況。
細(xì)胞與其周圍環(huán)境發(fā)生力學(xué)相互作用時(shí),常伴隨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。有研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等,更趨于在較大剛度的基底上鋪展[10],其原因可能是細(xì)胞在較大剛度的基底上可以產(chǎn)生更大的張力,更利于細(xì)胞向周圍鋪展。另有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞可以通過(guò)黏著斑蛋白感受細(xì)胞外界應(yīng)力的變化,調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架狀態(tài),改變細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài);但黏著斑蛋白表達(dá)水平與剛度可能無(wú)相關(guān)性[11]。這提示細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的影響因素繁多,由多種理化因素共同調(diào)控。
本研究結(jié)果顯示,隨著基底剛度的增加,細(xì)胞的鋪展面積和最長(zhǎng)直徑/最短直徑明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01);細(xì)胞絲狀偽足數(shù)量和長(zhǎng)度也逐漸增加,1.0×106kPa基底剛度上甚至出現(xiàn)片狀偽足。本研究進(jìn)一步分析了不同剛度的基底對(duì)HeLa細(xì)胞骨架的影響,其肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的熒光成像顯示,較大的基底剛度上,應(yīng)力纖維分布廣泛且貫穿細(xì)胞質(zhì),隨著剛度的減少,應(yīng)力纖維數(shù)量亦減少。這說(shuō)明HeLa細(xì)胞對(duì)剛度的變化比較敏感。
對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,貼壁是細(xì)胞增殖的必要條件?;讋偠瓤梢杂绊慔eLa細(xì)胞的鋪展程度和細(xì)胞骨架的狀態(tài),或多或少可以改變細(xì)胞的增殖情況。Tilghman等[12]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖速度與基底剛度呈正相關(guān),但并非所有細(xì)胞均對(duì)基底剛度敏感。大量的研究探索了生物力學(xué)因素對(duì)不同細(xì)胞增殖行為的影響,亦得出類似結(jié)果[13-15]。此外,Wang等[13]不僅通過(guò)改變基底剛度促進(jìn)了表皮細(xì)胞的增殖,還誘導(dǎo)了表皮細(xì)胞的分化。有研究發(fā)現(xiàn),基底剛度可以改變一些腫瘤細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的反應(yīng),如Hui等[16]發(fā)現(xiàn)不同基底剛度上培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞經(jīng)順鉑和5-氟尿嘧啶治療后,軟基底上Hep-2細(xì)胞凋亡減少。Feng等[17]發(fā)現(xiàn),在較大基底剛度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞,對(duì)紫杉醇的藥物殺傷作用反應(yīng)更敏感。本研究中宮頸癌HeLa細(xì)胞屬于“剛度依賴性”細(xì)胞,較大的基底剛度上HeLa細(xì)胞的倍增時(shí)間縮短,增殖率增加。
綜上所述,宮頸癌HeLa細(xì)胞的形態(tài)和增殖情況隨著基底剛度的變化而變化。這提示,在塑料/玻璃培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞水平體外研究不能反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的真實(shí)情況,需要考慮剛度等微納力學(xué)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,準(zhǔn)確地模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境。宮頸癌HeLa細(xì)胞在不同基底剛度上的不同生長(zhǎng)狀態(tài)亦提示,不同組織器官上癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度存在差異,但與宮頸癌轉(zhuǎn)移部位的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。此外,與剛度相關(guān)的基因也可能成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。
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