王海利，張曉慷，張新剛

(山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250100)

近年來(lái)，隨著國(guó)家對(duì)生態(tài)環(huán)境的高度重視，化學(xué)農(nóng)藥準(zhǔn)入門檻越來(lái)越高，研制一種低毒低害、防效較好的化學(xué)農(nóng)藥也越來(lái)越難，因此，生防菌便成為近年來(lái)生物農(nóng)藥研發(fā)中的重點(diǎn)。芽孢桿菌是一類廣泛存在于自然界的腐生細(xì)菌，因其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、繁殖速度快[1]、種類和數(shù)量眾多，加之具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用，所以是廣大生物農(nóng)藥研發(fā)者的研發(fā)對(duì)象，目前已有越來(lái)越多的芽孢桿菌菌劑被開發(fā)應(yīng)用于市場(chǎng)。在農(nóng)業(yè)上，芽孢桿菌常被用于制造生物肥料和生物農(nóng)藥，如巨大芽孢桿菌可以被制成混合菌劑，噴灑于土壤表面，以達(dá)到降解土壤中極其難溶的含磷化合物的目的。根瘤菌和自生固氮菌一直被用作固氮菌株應(yīng)用于我國(guó)的微生物肥料中[2]。

黃瓜灰霉病是一種由真菌半知菌亞門灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers)侵染所引起的病害，在黃瓜栽培保護(hù)地可常年發(fā)病，近年來(lái)發(fā)病逐年趨重。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，灰霉病菌的拮抗微生物主要包括拮抗性真菌和拮抗性細(xì)菌，而芽孢桿菌則是灰霉病生物防治中研究和應(yīng)用的主要細(xì)菌[3]。目前，我國(guó)應(yīng)用拮抗細(xì)菌防治灰霉病的研究較少，而且大多由于直接應(yīng)用菌株和菌劑進(jìn)行病害防治，貨架期很難保證[4]，因此，如何研發(fā)出高效、穩(wěn)定的生防菌菌劑成為目前農(nóng)藥研究中的重點(diǎn)。為提高生防菌單位活菌量，筆者研究了一株芽孢桿菌SDNY-037對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果，并優(yōu)化了其發(fā)酵條件，為研制安全穩(wěn)定的生防制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株?；颐共【鶥c(Botrytiscinerea)由上海南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心生測(cè)試驗(yàn)室提供，芽孢桿菌SDNY-037由山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院工藝研究所生化試驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基。菌種活化培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，自來(lái)水1 000 mL，pH 7.2～7.4。菌種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自來(lái)水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.1種子菌液的制備。將保存的菌種轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化，活化后挑取部分菌落接于裝液量為100 mL的250 mL錐形瓶的牛肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h即得種子菌液。

1.2.2含菌量與吸光度相關(guān)性的測(cè)定。將生防菌活化后，轉(zhuǎn)接到牛肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵24 h，菌液分別稀釋5、10、20、40、80倍，每個(gè)稀釋倍數(shù)再進(jìn)行適當(dāng)稀釋，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌量[5]，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取平均值。菌液吸光度的測(cè)定：以牛肉湯培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定對(duì)應(yīng)菌液吸光度(OD600)，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，菌落數(shù)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3菌液對(duì)活體Bc和離體Bc的初步防治方法。①活體。取1 mL發(fā)酵48 h的發(fā)酵液，均勻噴灑到黃瓜幼苗(子葉期)葉片上，置通風(fēng)處晾干，將Bc菌餅(培養(yǎng)4 d左右)倒置貼于黃瓜葉片上，以不噴菌液的黃瓜幼苗作為對(duì)照，置于保濕箱中發(fā)病。②離體。挑取活化好的生防菌菌落均勻點(diǎn)在菌種活化培養(yǎng)基上，中間接Bc菌餅，置于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。

1.2.4.1碳源篩選。分別選取葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖等量替換牛肉湯培養(yǎng)基中的碳源，以牛肉膏作為對(duì)照。以1%的接種量將種子液接種至液體培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶裝液量為100 mL)，在28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法，分別計(jì)算菌落總數(shù)。

1.2.4.2氮源篩選。分別用大豆粉、尿素、氯化銨、硫酸銨、酵母膏等量替換牛肉湯培養(yǎng)基中的氮源，以蛋白胨作為對(duì)照，其他條件同“1.2.4.1”，計(jì)算不同氮源中的菌落總數(shù)。

1.2.5發(fā)酵條件的優(yōu)化。對(duì)生防菌株發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量、裝液量等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)酵時(shí)間設(shè)2、3、4 d；初始pH設(shè)3、5、7、9、11；接種量設(shè)1%、3%、5%、7%、9%、11%；裝液量為250 mL的錐形瓶分別裝液30、50、70、100、120 mL；其余條件同“1.2.4”，計(jì)算不同條件下的菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1菌密度與吸光度的相關(guān)性由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=95.97x-3.429 8,R2=0.991 1，相關(guān)性較好，故可用液體培養(yǎng)基的OD600來(lái)計(jì)算活菌量。

圖1 菌密度與吸光度的相關(guān)性Fig.1 The correlation between the density of bacteria and the absorbance

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化以蛋白胨為固定氮源，選擇不同碳源培養(yǎng)菌株。由圖2可知，以麥芽糖為碳源時(shí)，活菌量達(dá)到最大，約為2.82×109cfu/mL,較以牛肉膏為碳源時(shí)的菌株活菌量提高了40%左右。

圖2 不同碳源培養(yǎng)基及其菌落數(shù)Fig.2 Different carbon source culture medium and its bacterial colonies

以牛肉膏作為固定碳源，選擇不同氮源培養(yǎng)菌株。由圖3可知，以蛋白胨為氮源時(shí)，活菌量達(dá)到最大，約為9.2×108cfu/mL，其他氮源對(duì)于提高菌株活菌量影響不大。

圖3 不同氮源培養(yǎng)基及其菌落數(shù)Fig.3 Different nitrogen source culture medium and its bacterial colonies

2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1菌株發(fā)酵時(shí)間。由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，菌株活菌量達(dá)到最大，約為3.36×109cfu/mL，較發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)的菌株活菌量提高了9%左右。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間及其菌落數(shù)Fig.4 Different fermentation time and its bacterial colonies

2.3.2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基pH。由圖5可知，當(dāng)pH為5時(shí)，菌株活菌量達(dá)到最大，約為1.8×109cfu/mL，較pH為7時(shí)的菌株活菌量提高了32%左右。

圖5 不同pH及其菌落數(shù)Fig.5 Different pH and its bacterial colonies

2.3.3菌株接種量。由圖6可知，當(dāng)接種量占總體積的3%時(shí)，菌株活菌量達(dá)到最大，約為2.82×109cfu/mL，較接種量為1%時(shí)的菌株活菌量提高了4%左右。

圖6 不同接種量及其菌落數(shù)Fig.6 Different inoculation amount and its bacterial colonies

2.3.4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量。結(jié)果表明，當(dāng)250 mL錐形瓶裝液量為120 mL時(shí)，菌株活菌量達(dá)到最大，約為1.6×109cfu/mL，較裝液量為100 mL時(shí)的菌株活菌量提高了3%左右。

2.4菌株發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉的防治效果

2.4.1離體防效。由圖7可知，培養(yǎng)4 d左右的菌株對(duì)黃瓜灰霉的離體防效比較明顯，點(diǎn)菌樣的周圍，黃瓜灰霉菌的生長(zhǎng)受到抑制，只能向未點(diǎn)樣的部分?jǐn)U散生長(zhǎng)。

注：編號(hào)1、2是1株芽孢桿菌SDNY-037分別轉(zhuǎn)接到2個(gè)斜面Note:The number 1 and 2 indicated that one Bacillus SDNY-037 was transferred to two slopes,respectively圖7 生防菌SDNY-037對(duì)黃瓜灰霉的離體防效Fig.7 Bio-control effect of SDNY-037 to Botrytis cinerea in vitro

2.4.2活體防效。接種致病菌48 h時(shí)，菌株發(fā)酵液防效約為75%，72 h時(shí)則基本無(wú)防效，說(shuō)明菌株發(fā)酵液具有一定的防效，但是要提高防效，還需提高菌體密度。

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于生防細(xì)菌的報(bào)道較多，利用生防菌進(jìn)行生物防治也有了較大的進(jìn)展，并成為多樣化的發(fā)展趨勢(shì)[6]，但提高菌株活菌量仍是提高生防菌劑防效的重要基礎(chǔ)。該研究就生防菌的發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，適合該菌株生長(zhǎng)的碳源、氮源分別是蔗糖和蛋白胨；在發(fā)酵時(shí)間為3 d、pH為5、接種量占總體積的3%、250 mL錐形瓶裝液量為120 mL條件下，菌株活菌量均達(dá)到最大，為進(jìn)一步提高菌株活菌量打下了基礎(chǔ)。

不同細(xì)菌最適發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件均不相同，可能是由于不同生理小種的特征不同所致[7]。該研究通過(guò)試驗(yàn)初步篩選了部分最適發(fā)酵條件，但對(duì)于大幅度提高該菌株的活菌量和生防效果，還需進(jìn)一步研究，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，微量元素對(duì)提高菌量以及芽孢的形成具有明顯的影響[8]，這對(duì)于產(chǎn)品的保存是非常有利的。

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