褚吉興，孟凡娟，張廣成，耿緒云，王麗燕*

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)作為我國重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值。但是，近年來對(duì)蝦病害的發(fā)生使對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了重大經(jīng)濟(jì)損失，尤以病毒性疾病發(fā)生最為嚴(yán)重[1]。其中，白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)自 1992 年暴發(fā)以來就成為我國及東南亞地區(qū)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)主要病毒性病原之一，目前尚無有效防治策略。

越來越多的研究表明，自噬在病毒侵染增殖中發(fā)揮了重要作用[2-7]。自噬作為一種溶酶體降解途徑，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與能量平衡的一種重要的細(xì)胞學(xué)過程。在酵母中，已經(jīng)有超過36種自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,ATG)被鑒定，而這些基因中的大部分都在哺乳動(dòng)物中存在相應(yīng)的同源基因[8-9]。自噬相關(guān)基因參與到調(diào)控自噬機(jī)制的整個(gè)過程當(dāng)中，包括自噬泡的形成、自噬體膜的延伸、自噬小體與溶酶體融合以及自噬溶酶體的降解等[9-12]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬可成功地抑制胞內(nèi)病毒的復(fù)制及增殖，如Sindbis病毒和煙草花葉病毒感染宿主時(shí)[13]；有的病毒通過抑制自噬促進(jìn)自身增殖，如I型單純皰疹病毒和I型人類免疫缺陷病毒[14-16]；另有一些昆蟲類病毒如黃病毒已進(jìn)化出相關(guān)機(jī)制調(diào)控Akt-mTOR通路，從而可以逃逸宿主自噬免疫防御達(dá)到增殖的目的[17-19]。西米利奇森林病毒的增殖則會(huì)被宿主自噬水平的增強(qiáng)所抑制[20-21]?？梢?，不同的病毒與宿主自噬的相互作用關(guān)系亦不一樣。

目前針對(duì)細(xì)胞自噬展開的研究越來越多，但是對(duì)蝦自噬研究仍鮮見報(bào)道。筆者首次對(duì)凡納濱對(duì)蝦自噬相關(guān)基因LvATG6進(jìn)行了克隆，并對(duì)其組織表達(dá)特征和在WSSV感染后的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，以期為對(duì)蝦自噬與病毒作用關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)，為對(duì)蝦免疫和病毒防治策略的研究開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)所用的凡納濱對(duì)蝦購自天津恒興富民水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社，體重(10.2±1.0) g，體長(10.0±1.6)cm。試驗(yàn)前將其置于循環(huán)水族缸內(nèi)暫養(yǎng)，養(yǎng)殖溫度為25 ℃，每天喂食1次，使其適應(yīng)新環(huán)境，選取健康有活力的對(duì)蝦用于試驗(yàn)。用于刺激對(duì)蝦的WSSV病毒懸液參照文獻(xiàn)[22]制備。

1.1.2試劑。TRIzolTMReagent購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物公司；pMD18-T載體連接試劑盒購自大連寶生物公司；DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物公司；其他藥品均為國產(chǎn)分析純；引物序列由華大基因公司合成，引物序列見表1。

1.1.3儀器。PCR儀(Applied Biosystems)、GelDocTMXR成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、Nano Drop 2000分光光度計(jì)(Thermo)、電泳儀(Bio-Rad)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

表1 試驗(yàn)所用引物序列信息

1.2方法

1.2.1凡納濱對(duì)蝦組織樣品制備。選取7尾健康有活力的凡納濱對(duì)蝦，分別取鰓、肝胰臟、心臟、血細(xì)胞、前腸、中腸、后腸、表皮、神經(jīng)、肌肉，凍存于液氮中備用。

另取30尾健康有活力的凡納濱對(duì)蝦，注射10 μL病毒懸液[22]。將感染病毒后的對(duì)蝦置于水溫為25 ℃的循環(huán)水族缸內(nèi)養(yǎng)殖，分別在注射病毒后的6、12、24、36、48 h，各取5尾對(duì)蝦的鰓和肝胰臟組織分別凍存于液氮中備用。

1.2.2凡納濱對(duì)蝦總RNA提取及cDNA合成。按照提取總RNA的TRIzol試劑盒說明書分別提取正常凡納濱對(duì)蝦及感染W(wǎng)SSV不同時(shí)間各組織總RNA，利用Nano Drop 2000分光光度計(jì)以及瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行純度和定量分析。樣品檢測(cè)合格后，取1 μg RNA作為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以引物AOLP、BDA為接頭引物合成cDNA后用于基因全長克隆，使用隨機(jī)引物并以感染病毒后對(duì)蝦組織總RNA為模板合成cDNA用于半定量PCR檢測(cè)。

1.2.3LvATG6基因克隆。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)凡納濱對(duì)蝦自噬相關(guān)基因ATG6全長特異性引物L(fēng)vATG6-F、LvATG6-R，以“1.2.2”中合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。25 μL的反應(yīng)體系中包含無酶水8.5 μL、LvATG6-F引物1 μL、LvATG6-R引物1 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、鰓cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃冷卻。產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)，切膠回收后與pMD18-T載體進(jìn)行16 ℃連接，轉(zhuǎn)化DH5α后挑取單菌落送至蘇州金唯智生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4LvATG6基因序列的生物信息學(xué)分析。使用在線網(wǎng)址(http://web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和分子量；應(yīng)用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域特征。應(yīng)用在線翻譯軟件(http://web.expasy.org/translate/)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行氨基酸翻譯；應(yīng)用Clustal W與MEGA 5.0.1對(duì)不同物種的ATG6蛋白比對(duì)和分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5LvATG6組織表達(dá)分析。 半定量PCR檢測(cè)目的基因差異表達(dá)所用組織為正常凡納濱對(duì)蝦鰓、肝胰臟、心臟、血細(xì)胞、前腸、中腸、后腸、表皮、神經(jīng)、肌肉，以18SrRNA-F、18SrRNA-R為引物進(jìn)行PCR，25 μL的反應(yīng)體系中包含無酶水8.5 μL、18SrRNA-F引物1 μL、18SrRNA-R引物1 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、各組織cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min，4 ℃冷卻。產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)整各組織模板加入量，使18SrRNA引物擴(kuò)增出來的條帶亮度一致，記錄各組織模板的加入量。按照相同條件，換用LvATG6-semi-F、LvATG6-semi-R引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6WSSV侵染后LvATG6的組織表達(dá)分析。以WSSV感染不同時(shí)間的鰓和肝胰臟組織cDNA為模板進(jìn)行半定量PCR，25 μL的反應(yīng)體系中包含無酶水8.5 μL、LvATG6-semi-F引物1 μL、LvATG6-semi-R引物1 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、各組織cDNA根據(jù)調(diào)整量添加。PCR反應(yīng)同“1.2.5”中條件。產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。18SrRNA作為內(nèi)參。

2 結(jié)果與分析

2.1LvATG6基因克隆及序列分析該研究利用PCR技術(shù)克隆獲得了LvATG6 cDNA全長(圖1)，共1 275 bp，編碼424個(gè)氨基酸，蛋白分子量為51.5 kD，等電點(diǎn)為5.47，含有1個(gè)自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)域——APG6結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖2)，LvATG6編碼的蛋白與節(jié)肢動(dòng)物門其他物種自噬相關(guān)蛋白具有很高的序列相似性，其中與臭蟲、白蟻ATG6基因編碼的自噬相關(guān)蛋白序列相似性高達(dá)59%。利用MEGA5.0.1軟件的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖3)，LvATG6蛋白獨(dú)自一支，但與臭蟲的親緣關(guān)系較近。

2.2LvATG6的組織表達(dá)特征運(yùn)用半定量PCR技術(shù)檢測(cè)LvATG6基因在凡納濱對(duì)蝦10種組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖4)，LvATG6在檢測(cè)的凡納濱對(duì)蝦10種組織中均有表達(dá)，在前腸、中腸、后腸中的表達(dá)量最高。

2.3WSSV侵染后LvATG6的組織表達(dá)特征利用半定量PCR技術(shù)，分別檢測(cè)LvATG6感染W(wǎng)SSV后6、12、24、36、48 h在鰓和肝胰臟組織中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示(圖5)，在病毒感染6和12 h時(shí)，鰓組織中的LvATG6表達(dá)量最高，而在24、36和48 h時(shí)表達(dá)量較低；在病毒感染6 h時(shí)，LvATG6在肝胰臟組織中表達(dá)量很低，而在12～48 h時(shí)出現(xiàn)顯著的基因表達(dá)上調(diào)。

3 討論

自噬過程普遍存在于真核生物中，不僅可維持細(xì)胞內(nèi)自身物質(zhì)平衡，在病原感染方面發(fā)揮的作用也越來越被重視[23-24]，其發(fā)生的過程嚴(yán)格受到自噬相關(guān)基因調(diào)控。

該研究成功獲得了凡納濱對(duì)蝦自噬相關(guān)基因LvATG6的cDNA全長，該基因編碼的蛋白含有1個(gè)自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)域——APG6結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)自噬體的形成。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LvATG6基因與節(jié)肢動(dòng)物門其他物種該基因具有較高的同源性，其中與臭蟲、白蟻ATG6基因編碼的自噬相關(guān)蛋白序列相似性高達(dá)59%，說明LvATG6基因與已被報(bào)道的其他物種的ATG6基因在氨基酸組成和潛在功能上無較大差異，是一種在各物種中比較保守的自噬相關(guān)蛋白。

注：黑色方框?yàn)槠鹗济艽a子，*表示終止密碼子；紅色框內(nèi)為APG6結(jié)構(gòu)域Note:The initiation codon(ATG) was boxed in black,the stop codon was marked with an asterisk,the APG6 domain was boxed in red圖1 凡納濱對(duì)蝦LvATG6 cDNA全長及編碼的氨基酸序列Fig.1 Full-length of L.vannamei ATG6 cDNA and deduced amino acid sequence

注：臭蟲(XP_014247219.1)；傳粉榕小蜂(XP_011496307.1)；麥芽蜂(XP_015589297.1)；蘆蜂(XP_017879818.1)；蕪菁葉蜂(XP_012258889.1)；白蟻(PNF22772.1)Nnote:Cimex lectularius(XP_014247219.1)；Ceratosolen solmsi marchali(XP_011496307.1)；Cephus cinctus(XP_015589297.1)；Ceratina calcarata(XP_017879818.1)；Athalia rosae(XP_012258889.1)；Cryptotermes secundus(PNF22772.1)圖2 凡納濱對(duì)蝦LvATG6與其他物種ATG6的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 Analysis of amino acid sequence alignment based on LvATG6 gene of L.vannamei and other species ATG6

注：麥芽蜂(XP_015589297.1)；蕪菁葉蜂(XP_012258889.1)；蘆蜂(XP_017879818.1)；蜂類(XP_015439892.1)；傳粉榕小蜂(XP_011496307.1)；麗蠅蛹集金小蜂(XP_001601439.1)；白蟻(PNF22772.1)；臭蟲(XP_014247219.1)；茶翅蝽(XP_014273603.1)；子彈蟻(XP_014479707.1)；內(nèi)華達(dá)古白蟻(XP_021921721.1)；多胚跳小蜂(XP_014219117.1)Note:C.cinctus(XP_015589297.1)；A.rosae(XP_012258889.1)；C.calcarata(XP_017879818.1)；Dufourea novaeangliae(XP_015439892.1)；C.solmsi marchali(XP_011496307.1)；Nasonia vitripennis(XP_001601439.1);C.secundus(PNF22772.1)；Cimex lectularius(XP_014247219.1)；Halyomorpha halys(XP_014273603.1)；Dinoponera quadriceps(XP_014479707.1)；Zootermopsis nevadensis(XP_021921721.1)；Copidosoma floridanum(XP_014219117.1)圖3 LvATG6與其他物種ATG6之間的進(jìn)化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of LvATG6 with ATG6s from other species

注：1.心；2.肝胰臟；3.鰓；4.血細(xì)胞；5.前腸；6.中腸；7.后腸；8.表皮；9.神經(jīng)；10.肌肉Note:1.heart；2.Hepatopancreas；3.gills；4.blood cells；5.foregut；6.midgut；7.hindgut；8.skin；9.nerves；10.muscles圖4 LvATG6在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的分布Fig.4 Expression of LvATG6 of L.vannamei in different tissues

圖5 WSSV感染不同時(shí)間LvATG6在凡納濱對(duì)蝦鰓和肝胰臟組織中的表達(dá)變化Fig.5 Expression of LvATG6 in the hepatopancreas and gills of L.vannamei after WSSV infection

LvATG6組織表達(dá)研究顯示，LvATG6在檢測(cè)的10種對(duì)蝦組織中均有表達(dá)，表明自噬是一種在對(duì)蝦機(jī)體細(xì)胞中廣泛存在的現(xiàn)象，不具有組織特異性，但其表達(dá)量在不同組織中有差異，在鰓和腸道組織中的表達(dá)量均較高。鰓和腸道組織是對(duì)蝦重要的免疫器官，也是WSSV入侵的靶器官[25]。自噬相關(guān)基因LvATG6的高表達(dá)暗示自噬在鰓和腸道免疫中可能也發(fā)揮了重要作用。

為進(jìn)一步揭示自噬相關(guān)蛋白LvATG6及自噬在WSSV感染中的作用，筆者檢測(cè)了WSSV感染后，凡納濱對(duì)蝦LvATG6基因在對(duì)蝦鰓和肝胰臟組織中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)LvATG6在病毒感染不同時(shí)間表達(dá)差異顯著，在WSSV的靶組織鰓中LvATG6表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分析推測(cè)病毒侵染早期調(diào)控或影響了自噬相關(guān)基因LvATG6及細(xì)胞自噬，宿主細(xì)胞為避免病毒對(duì)自身的利用和增殖，感染后期相對(duì)地下調(diào)LvATG6表達(dá)，對(duì)抗病毒的侵染增殖[26]。

目前，自噬在病毒侵染增殖中的作用主要有3個(gè)方面[14，27-32]：①自噬抑制病毒增殖。Shelly等[27]使用對(duì)果蠅無致病性的VSV分別感染Atg-1和Atg-5沉默的果蠅后，試驗(yàn)組的果蠅大量死亡而且病毒滴度顯著高于對(duì)照組，表明在果蠅體內(nèi)自噬對(duì)水泡性口炎病毒的感染起重要的拮抗作用。②病毒劫持自噬。人皰疹病毒可以通過抑制自噬的上游激活信號(hào)通路、影響自噬相關(guān)蛋白的功能、干擾自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制以及抑制自噬相關(guān)的免疫應(yīng)答等方式來破壞自噬、阻滯自噬的清除作用[28]。單純皰疹病毒I型的神經(jīng)毒性蛋白可以結(jié)合Beclin 1而阻止自噬過程的發(fā)生[14]，除以Beclin 1為靶點(diǎn)外，HSV-1的ICP34.5蛋白還能通過招募 PP1α 使 PKR下游蛋白eIF2α去磷酸化抑制自噬體的形成。③自噬促進(jìn)病毒增殖。鼠肝炎病毒和SARS病毒感染之后可以在自噬泡上發(fā)現(xiàn)病毒蛋白；馬動(dòng)脈炎病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的復(fù)合體在自噬泡上被發(fā)現(xiàn)；輪狀病毒感染后，病毒復(fù)制相關(guān)蛋白NSP4可以從未成熟的雙層膜小泡中移行至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并且與NSP5及LC3Ⅱ有共定位現(xiàn)象[29]。黃病毒科的登革熱病毒可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而且促進(jìn)自噬有助于病毒的復(fù)制[30]；柯薩奇病毒敲除Atg7基因后，病毒的復(fù)制水平顯著下降以及成熟病毒粒子的釋放受到抑制[31]；在新城疫病毒感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用RNAi干擾分別沉默Atg5和Beclin1后，病毒滴度都有顯著下降的現(xiàn)象[32]；口蹄疫病毒在感染時(shí)也發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白 2B、2C 和3A 與 LC3 共定位而結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 與 Atg-5 共定位的現(xiàn)象，并且刺激自噬有能夠增強(qiáng)病毒的水平[33]?？梢娮允晒δ艿陌l(fā)揮是具有病毒種類特異性的。因此，了解自噬與病毒感染之間的關(guān)系對(duì)控制病害的傳播意義重大。

總之，筆者通過克隆獲得了LvATG6 cDNA全長，對(duì)其組織表達(dá)特征進(jìn)行了分析，并對(duì)LvATG6在WSSV感染中的作用進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明對(duì)蝦自噬在WSSV侵染增殖中發(fā)揮了一定作用。但是，對(duì)蝦自噬發(fā)生究竟是促進(jìn)病毒增殖，還是抑制病毒增殖，有待于深入研究。

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