宋巧珍，鄒枘峰，張亦陳，耿緒云，劉逸塵 *

(1.天津市動植物抗性重點實驗室/天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300221)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦(Pacific White Shrimp)，隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱，其具有生長快、繁殖期長、含肉率高和便于活蝦運輸?shù)忍攸c，是世界范圍內(nèi)對蝦養(yǎng)殖的三大品種之一[1]。但近年來，在病原活躍、養(yǎng)殖環(huán)境惡化和宿主抵抗力下降三方面因素共同作用下，對蝦病害頻發(fā)，給我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，因此深入開展對蝦免疫防御機制研究，增強其抗病能力，顯得尤為重要。

凡納濱對蝦屬于無脊椎動物，缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，只能依靠天然免疫系統(tǒng)(細(xì)胞免疫和體液免疫)來抵御和殺死入侵的病原[2-3]。其體液免疫主要利用凝血級聯(lián)反應(yīng)、酚氧化酶激活系統(tǒng)等一系列效應(yīng)因子參與免疫應(yīng)答反應(yīng)[4]。此外，蝦蟹類體內(nèi)的一些其他組分如絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑等分子會作為級聯(lián)反應(yīng)中的調(diào)控因子參與免疫反應(yīng)。絲氨酸蛋白酶家族作為一種蛋白水解酶，其以絲氨酸為活性中心，在生物有機體中起著重要的作用[5-6]。clip-SP家族在氨基端含有1個clip結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域最初在馬蹄蟹的凝固酶原中被發(fā)現(xiàn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)它在免疫反應(yīng)中具有重要調(diào)節(jié)功能[7]，其中6個半胱氨酸可形成3個鏈內(nèi)二硫鍵[8-9]；羧基端含有絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域(SP結(jié)構(gòu)域)，其中絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸這3個氨基酸會形成催化三聯(lián)體發(fā)揮作用。無脊椎動物中，絲氨酸蛋白酶家族在胚胎發(fā)育和防御反應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，例如馬蹄蟹的凝血反應(yīng)[10]、果蠅抗菌肽的合成[11]、昆蟲和甲殼綱動物中酚氧化酶原系統(tǒng)的激活等[12-13]。同時，補體系統(tǒng)(包括經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑)必須先通過一系列絲氨酸蛋白酶(serine proteases,SP)的酶促級聯(lián)反應(yīng)激活后才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。經(jīng)典途徑中，對抗原抗體復(fù)合物(IC)的識別由C1q介導(dǎo)，其中的SP主要是C1r和C1s；凝集素途徑中，識別分子是甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)[14-15]，MBL識別并結(jié)合外源病原物質(zhì)，進(jìn)一步與MBL相關(guān)的SP(MBL Associated Serine Proteinase,MASP)結(jié)合形成復(fù)合物并激活補體因子C3，形成膜攻擊復(fù)合物(MAC)，導(dǎo)致異源微生物裂解死亡，進(jìn)而發(fā)揮免疫作用[16-17]。該研究擬獲得凡納濱對蝦Lv-SP基因，探討序列特點及組織分布特征，并分析其應(yīng)答病毒侵染的表達(dá)變化模式，以期為深入探討其作為免疫調(diào)控基因在對蝦防御應(yīng)答過程中的作用機制奠定基礎(chǔ)，并應(yīng)用于對蝦的健康養(yǎng)殖和病害防治。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究材料。健康的凡納濱對蝦(購于天津市西青區(qū)對蝦養(yǎng)殖基地)，體長11～14 cm，體重9～14 g，于實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中(16 ℃，鹽度10‰，氧氣充足)暫養(yǎng)4～5 d再進(jìn)行試驗。

1.1.2載體和菌株。pMD18-T-Vector (TaKaRa )，大腸桿菌DH5α菌種由天津師范大學(xué)水生生物學(xué)研究室保存。

1.1.3主要試劑。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工)、ExTaq酶(TaKaRa)、2×TaqPCR Master Mix (Promega)、LB液/固體培養(yǎng)基(生工)、M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)、GoTaq?MasterMix (Promega)、T4DNA連接酶(TaKaRa)等。

1.1.4主要儀器。PCR儀(BIO-RAD)、電泳儀(DYY-6C)、超凈工作臺(SW-CJ-1FD)、7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems)、移液器(Eppendorf)等。

1.2方法

1.2.1凡納濱對蝦總RNA提取及cDNA合成。利用Trizol方法提取凡納濱對蝦血細(xì)胞、肝、鰓等組織的RNA，用于后期基因克隆操作，經(jīng)1% MOPs瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測，再通過NANO Drop 2000分光光度計進(jìn)行定量檢測，確認(rèn)RNA濃度和完整性后利用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄體系并且加入接頭引物BDA、AOLP(表1)進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2引物設(shè)計與Lv-SPORF區(qū)域的擴增。從實驗室前期凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選出SP基因進(jìn)行引物設(shè)計(生工)，引物包括Lv-SPF1、Lv-SPR1和Lv-SPF2、Lv-SPR2(表1)共2對。利用PCR技術(shù)擴增目的基因，電泳檢測后將PCR產(chǎn)物利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化后連接到pMD18-T-Vector上，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，送英濰捷基公司進(jìn)行測序，利用Bioedit軟件和在線BLAST程序分析測序結(jié)果與目的基因是否一致，進(jìn)而確定是否獲得Lv-SP基因ORF區(qū)。

1.2.3生物信息學(xué)分析。首先利用Expasy的在線分析工具(http://web.expasy.org)對Lv-SP基因ORF區(qū)進(jìn)行翻譯獲得蛋白質(zhì)序列、預(yù)測其分子量及等電點、利用其SMART程序分析Lv-SP蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，并利用其SignalP 4.1 Server分析其是否含有信號肽，通過TMHMM 2.0對Lv-SP蛋白序列進(jìn)行跨膜分析。使用Bioedit、ClustalX 1.83以及MEGA 6.0軟件對Lv-SP氨基酸和其他物種如中國明對蝦、中華絨螯蟹、果蠅等的SP、SPH氨基酸序列進(jìn)行多重比對，并使用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap=10000)。

1.2.4Lv-SP基因組織表達(dá)分析。根據(jù)克隆的Lv-SP基因序列，設(shè)計熒光定量PCR試驗組引物L(fēng)v-SPqf，Lv-SPqr和對照組引物β-actinf，β-actinr(表1)，將凡納濱對蝦各組織提取的RNA反轉(zhuǎn)成濃度相近的cDNA，參考GoTaq?MasterMix說明，利用熒光定量PCR方法檢測Lv-SP基因在凡納濱對蝦不同組織中表達(dá)量的差異。定量PCR反應(yīng)體系設(shè)計為GoTaq?MasterMix 12.5 μL，Nuclease-Free Water 8.50 μL，引物1 μL，cDNA 2 μL，總體積25 μL。定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40個循環(huán)；最后進(jìn)行融解曲線分析。所獲得的數(shù)據(jù)利用2-△△Ct法和t檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析并計算Lv-SP基因相對表達(dá)量的顯著性差異。

1.2.5人工感染白斑桿狀病毒(WSSV)對凡納濱對蝦Lv-SP基因表達(dá)的影響。人工感染克氏原螯蝦富集足量的WSSV病毒，并稀釋到105拷貝數(shù)/μL。從試驗組和對照組各選取50只經(jīng)檢測的健康凡納濱對蝦，分別注射10 μL WSSV 和Tris-NaCl緩沖液(TN-buffer，用于稀釋W(xué)SSV)，分別在注射后0、0.5、5.0、12.0、24.0、48.0和72.0 h抽取對蝦血淋巴，提取血細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，設(shè)計對照組引物TPI-qf，TPI-qr(表1)，利用qPCR分析凡納濱對蝦Lv-SP基因的表達(dá)變化特征(方法同“1.2.4”)。

表1 試驗所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1Lv-SP基因cDNA序列特征及生物信息學(xué)分析Lv-SP基因包含1個1 104 bp的ORF區(qū)，編碼367個氨基酸(圖1)，預(yù)測其蛋白分子量為41 kD，等電點為6.93。SignalP 4.1 Server預(yù)測結(jié)果顯示：Lv-SP氨基酸序列氨基端含有23個氨基酸的信號肽，同時TMHMM 2.0預(yù)測顯示Lv-SP蛋白位于細(xì)胞外發(fā)揮作用。SMART預(yù)測結(jié)果顯示Lv-SP蛋白含有1個clip結(jié)構(gòu)域和1個高度保守的TryP-SPc結(jié)構(gòu)域。在clip結(jié)構(gòu)域中，包含6個半胱氨酸，可以形成3個二硫鍵；在TryP-SPc結(jié)構(gòu)域中，包含SP家族中3個典型的氨基酸組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和絲氨酸(Ser)，形成催化三聯(lián)體發(fā)揮功能。

注：藍(lán)色方框表示信號肽，黑色下劃線表示clip結(jié)構(gòu)域，紅色下劃線表示TryP-SPc結(jié)構(gòu)域，黑色方框表示6個半胱氨酸(C)，紅色方框表示組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和絲氨酸(S)Note：The sequence in blue box represents the signal peptide,the clip domain is underlined by black line,the TryP-SPc domain is underlined by red line,the bases (C) in black box represents six cysteines and the bases in red box represents histidine (H),aspartic acid(D) and serine (S)圖1 Lv-SP基因的cDNA序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列Fig.1 The ORF cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence of Lv-SP

2.2Lv-SP的多重序列比對及進(jìn)化發(fā)生分析將Lv-SP氨基酸序列與其他物種SP氨基酸序列進(jìn)行多重比對(圖2)發(fā)現(xiàn)，這12種SP及SPH序列在蛋白水平上具有較高序列相似性。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹顯示：Lv-SP蛋白與南美白對蝦、中華絨螯蟹相似性比較高，親緣關(guān)系比較近，進(jìn)化上為一個亞群；而與按蚊、小蜂窩甲蟲親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)(圖3)。

2.3Lv-SP基因的組織表達(dá)分析利用RT-PCR分析Lv-SP基因在不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：該基因在凡納濱對蝦的血細(xì)胞、肝、鰓、胃等9個組織中均有表達(dá)，其中在鰓和血細(xì)胞中的表達(dá)量較高，在心和肝中表達(dá)量較低(圖4)。

2.4WSSV侵染對凡納濱對蝦Lv-SP基因表達(dá)的影響WSSV的體內(nèi)人工感染試驗結(jié)果顯示，注射WSSV后24 h之內(nèi)Lv-SP基因在試驗組和對照組的表達(dá)均沒有明顯變化，但在感染后48.0 h和72.0 h，Lv-SP基因的表達(dá)量均有極顯著上調(diào)趨勢(P<0.01)(圖5)。由此推測Lv-SP基因可能在病毒感染晚期參與了應(yīng)答WSSV的免疫防御反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

在無脊椎動物中，含clip結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶家族成員在胚胎發(fā)育和防御反應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用，目前對于絲氨酸蛋白酶在節(jié)肢動物中的作用機理報道還比較少。已有研究表明絲氨酸蛋白酶中clip結(jié)構(gòu)域都含有6個保守的半胱氨酸，可以形成3個二硫鍵，在該研究中，克隆得到的Lv-SP基因編碼的氨基酸具有一個典型的信號肽結(jié)構(gòu)，表明它在胞外執(zhí)行功能，其氨基端的clip結(jié)構(gòu)域含有6個保守的半胱氨酸，可以形成3個二硫鍵，預(yù)測形成的3個二硫鍵在穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)中可能發(fā)揮一定的作用，clip結(jié)構(gòu)域可能提供了一個用于蛋白酶和其上游激活劑、下游蛋白底物或調(diào)節(jié)酶活力的輔因子相互作用的位點，使得在局部損傷和感染源的部位可以形成酶復(fù)合物。利用在線分析軟件SMART預(yù)測：Lv-SP的C端含有的Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域中，其催化三聯(lián)體是由His、Asp和Ser這3個氨基酸形成的，該結(jié)構(gòu)域主要執(zhí)行著消化和催化的功能。該研究獲得的Lv-SP可能屬于絲氨酸蛋白酶基因家族中的新成員。將Lv-SP蛋白序列在NCBI中進(jìn)行Blast P比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該蛋白與其他物種的SP蛋白大致有40%～80%的相似度，在蝦類中相似度都為60%以上，并且均具有較保守的clip結(jié)構(gòu)域和SP結(jié)構(gòu)域(Tryp-SPc)。之前有研究顯示，普通的SP家族成員通常僅具有消化的功能，而含有clip結(jié)構(gòu)域的SP主要參與免疫應(yīng)答過程。Lv-SP與其他對蝦SP和已報道的凡納濱對蝦Lv-SP2在氨基酸序列上的差異，表明它們在特征和功能上可能同樣存在著顯著區(qū)別，該研究中的Lv-SP基因可能在免疫調(diào)控過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。

注：Lv SP2(凡納濱對蝦AFW98996.1)；Fc SP(中國明對蝦，AFW98989.1)；Es c-SP(中華絨螯蟹，AKN46053.1)；Pm c-SP(斑節(jié)對蝦，ACP19561.1)；Ha SP(端足蟲，XP_018023883.1)；Sp SP(擬穴青蟹，AUC65357.1)；Ag SP(按蚊，AAD38334.1)；Ad c-SP(大劣按蚊，ABE97918.1)；Pt c-SP(三疣梭子蟹，AFA42362.1)；Dm SP(果蠅，XP_017144359.1)；At SPH(小蜂窩甲蟲，XP_019880096.1)Note:Lv SP2 (Litopenaeus vannamei,AFW98996.1);Fc SP (Fenneropenaeus chinensis,AFW98989.1);Es c-SP (Eriocheir sinensis,AKN46053.1);Pm c-SP (Penaeus monodon,ACP19561.1);Ha SP (Hyalella azteca,XP_018023883.1);Sp SP (Scylla paramamosain,AUC65357.1);Ag SP (Anopheles gambiae,AAD38334.1);Ad c-SP (Anopheles dirus,ABE97918.1);Pt c-SP (Portunus trituberculatus,AFA42362.1);Dm SP (Drosophila miranda,XP_017144359.1);At SPH (Aethina tumida,XP_019880096.1)圖2 凡納濱對蝦Lv-SP與其他物種氨基酸序列多重比對Fig.2 Multi-alignment of Lv-SP with other SPs from different species

Lv-SP基因的組織表達(dá)特征分析能為預(yù)測其基因功能提供有價值的參考。Lv-SP基因在凡納濱對蝦中具有一定的組織表達(dá)特異性，在血細(xì)胞和鰓組織中表達(dá)量較高，而在心中表達(dá)量最低，血細(xì)胞和鰓都是重要的免疫器官或組織，鰓在對蝦中作為病原微生物的過濾器，是一個非常重要的免疫防御器官，這種器官上明顯的表達(dá)差異也許暗示著某種功能上的差異，Lv-SP基因在其中的高表達(dá)可能與宿主自身的免疫防御作用有關(guān)[18-20]，組織表達(dá)特征也間接表明了其在對蝦免疫調(diào)控過程中的作用。

圖3 凡納濱對蝦Lv-SP與其他物種SP的進(jìn)化發(fā)生分析Fig.3 Phelogenetic analysis of the Lv-SP with other SPs from different species

圖4 凡納濱對蝦Lv-SP基因組織表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of Lv-SP gene in different tissues

圖5 WSSV感染后凡納濱對蝦血細(xì)胞Lv-SP基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Lv-SP gene after WSSV challenge in hemocytes

甲殼動物缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，只能依靠自身天然免疫系統(tǒng)來抵抗外界各種病原體的入侵。對蝦WSSV是一種死亡率極高的病毒，實驗室條件下人工感染48.0 h內(nèi)就會出現(xiàn)較高的死亡率。探討對蝦關(guān)鍵免疫基因應(yīng)答WSSV侵染的表達(dá)變化特征，將有助于研究該基因在抗病毒免疫應(yīng)答過程中的作用。天津師范大學(xué)水生生物學(xué)研究室前期轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示Lv-SP基因具有較靈敏的應(yīng)答病毒侵染的特征，該研究利用qPCR技術(shù)，以WSSV感染后具有較穩(wěn)定表達(dá)水平的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(TPI)作為內(nèi)參基因，進(jìn)一步在凡納濱對蝦活體感染W(wǎng)SSV后不同時期精確分析了其血細(xì)胞中Lv-SP基因的表達(dá)變化特征。研究結(jié)果表明病毒感染的早期和中期，該基因?qū)Σ≡拇碳]有顯著應(yīng)答變化，但在病毒感染晚期(48.0 h和72.0 h)，Lv-SP呈現(xiàn)極顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.01)，該基因在對蝦血細(xì)胞中呈組成型表達(dá)，WSSV可以在一定范圍內(nèi)誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄水平的增強，Lv-SP可能通過上調(diào)自身表達(dá)，調(diào)控其所在的酚氧化酶激活途徑，進(jìn)而參與到作用于病原的防御應(yīng)答過程。

該研究克隆了凡納濱對蝦血細(xì)胞中的Lv-SP基因，探討了其序列及保守性特點，分析了其組織分布特征以及應(yīng)答病毒侵染的表達(dá)變化模式。作為一種分布較為廣泛的蛋白，它在免疫過程中的諸多應(yīng)答和級聯(lián)反應(yīng)中可能具有重要功能，未來可進(jìn)一步探討其精細(xì)的調(diào)節(jié)作用及在進(jìn)化上的意義。

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