張尤貞，顏秀梅，湯春蓮，李 琿，蔡一杰，許曉靖，吳 勛

(1.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽合肥 230091；2.安徽華澳生物技術(shù)有限公司，安徽合肥 230001)

目前，抗生素耐藥性的產(chǎn)生已嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康。一些觀點(diǎn)認(rèn)為，抗生素的不規(guī)范使用(包括不合理的劑量、給藥途徑、給藥間隔等)，是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因。因此，為了設(shè)計(jì)更合理的給藥方案，筆者將藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，以期在提高療效的同時(shí)，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)是豬細(xì)菌性肺炎的一種重要病原菌，能夠引起豬的胸膜肺炎，是豬的一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)傳染病。病豬呈現(xiàn)發(fā)熱(可高達(dá)42 ℃)，呼吸困難，剖檢時(shí)可發(fā)現(xiàn)纖維素性胸膜肺炎，多感染肺部?jī)蓚?cè)，65%的肺尾葉感染嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)到2%～10%，致死率約10%[1]。耐過(guò)豬可以攜帶病原持續(xù)幾個(gè)月)[2]，感染后仍保持健康的動(dòng)物就成為亞臨床病原攜帶者。一旦暴發(fā)該病,推薦盡快采用抗生素治療方法，早期及時(shí)治療是提高療效的重要條件。頭孢類、四環(huán)素類等抗生素都可用于臨床治療[3]。

頭孢喹肟是第4代頭孢菌素類抗生素，也是獸醫(yī)專用藥，目前已被用于治療由嗜血桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌等引起的呼吸道疾病以及由大腸桿菌和鏈球菌引起的乳房炎等疾病。目前，頭孢喹肟已在兔[4]、豬[5]等動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)。然而，關(guān)于頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的半體內(nèi)藥動(dòng)藥效學(xué)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

PK/PD同步模型可以反映藥物濃度與殺菌效應(yīng)之間的關(guān)系，能反映給藥后出現(xiàn)的時(shí)間-濃度-效應(yīng)過(guò)程，真實(shí)模擬宿主、藥物以及細(xì)菌三者的動(dòng)態(tài)相互變化關(guān)系。PK/PD模型[6]可大致分為體外PK/PD模型、半體內(nèi)PK/PD模型、體內(nèi)PK/PD模型3種。筆者利用半體內(nèi)PK/PD同步模型，研究頭孢喹肟在動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，旨在為治療由胸膜肺炎放線桿菌引起的呼吸道疾病提供合理的治療方案并減少臨床上耐藥菌的出現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑硫酸頭孢喹肟注射液(2.5% Cobacton)，批號(hào)A621B01，購(gòu)自英特威國(guó)際有限公司；頭孢喹肟對(duì)照品，含量80.9%，批號(hào)k0321205，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；乙腈，HPLC級(jí)，含量≥99.9%，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；甲酸，HPLC級(jí)，含量≥99.9%，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基Tryptic Soy Broth (TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基Tryptic Soy Agar (TSA)、新生牛血清和NAD氧化輔酶I均購(gòu)自于國(guó)產(chǎn)生化試劑公司。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)菌株

1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)管理。健康雜種豬(長(zhǎng)白×大白×杜洛克)10頭，體質(zhì)量25～30 kg，購(gòu)自安徽省某種豬場(chǎng)。整個(gè)試驗(yàn)期間，全部豬只自由飲水和采食，飼料為不含任何抗菌藥物的全價(jià)日糧。

1.2.2試驗(yàn)菌株。胸膜肺炎放線桿菌來(lái)自臨床分離菌株(生物I型中的1型)，保存于大豆卵磷脂肉湯(含5%NAD)中。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3菌液的復(fù)蘇和制備將冷凍保存的多殺性巴氏桿菌接種到含5%新生牛血清的TSB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，復(fù)蘇后的細(xì)菌劃線接種在含5%NAD的瓊脂培養(yǎng)基上，傳代培養(yǎng)5代，待細(xì)菌活力完全恢復(fù)后，再取單個(gè)菌落接種于含5%NAD的TSB肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)菌培養(yǎng)，以獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌。

1.4胸膜肺炎放線桿菌在肉湯培養(yǎng)基和血清中的最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)，具體試驗(yàn)步驟參考CLSI。先將頭孢喹肟?jī)?chǔ)備液(1 280 μg/mL)用含5%NAD的TSB肉湯培養(yǎng)基和血清在10 mL無(wú)菌玻璃管中倍比稀釋成試驗(yàn)所需的工作液。然后，再將稀釋好的工作液與處于對(duì)數(shù)期的菌懸液按照1∶1的體積比加入96孔板中，使96孔板中的菌液終濃度為5×105CFU/mL左右。同時(shí)，在96孔板上設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔(只含菌液，不含藥物)和陰性對(duì)照孔(只含培養(yǎng)基，不含菌液)，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，讀取結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.5頭孢喹肟在血清中的靜態(tài)殺菌動(dòng)力學(xué)曲線取1 mL空白血清稀釋的抗菌藥液，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌原液用空白血清稀釋到1×106CFU/mL后，取1 mL加到已知濃度抗菌藥的TSB肉湯和血清中，制得藥物濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 MIC和菌液終濃度約為5×107CFU/mL。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后分別在孵育0、2、4、6、8、12和24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.6給藥和采樣5頭健康豬采用靜脈注射1 mg/kg的頭孢喹肟，5頭健康豬肌內(nèi)注射1 mg/kg頭孢喹肟，在給藥前和給藥后5、15、30、45 min及1、2、3、4、6、8、12、24 h采集前腔靜脈血樣5 mL置于不含抗凝劑的塑料離心管中，室溫靜置30 min并避免陽(yáng)光照射，隨后在4 ℃冰箱中放置2 h，以加速血塊凝縮，然后在4 ℃下4 000 r/min 離心10 min，分離血清。血清樣品分裝成2份，保存于-80 ℃下，一份用于藥物濃度檢測(cè)，另一份用于藥效學(xué)試驗(yàn)。

1.7頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的半體內(nèi)藥效學(xué)研究將采集的空白血清和給藥后不同時(shí)段采集的樣品解凍后，使用孔徑0.22 μm的滅菌針式濾器過(guò)濾除菌，取適量除菌血清加入對(duì)數(shù)期的胸膜肺炎放線桿菌懸液，使血清樣品中胸膜肺炎放線桿菌的最終濁度為5×106CFU/mL左右，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后0、2、4、6、8、12和24 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)確定血清中活菌數(shù)。

1.8數(shù)據(jù)處理藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)采用WinNonlin 5.2藥動(dòng)學(xué)軟件(Pharsight Corporation，Mountain view，CA，USA)進(jìn)行分析。組織液中藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用非房室模型進(jìn)行處理，用梯形積分法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積(AUC)；每次給藥后的藥物峰濃度(Cmax)從擬合出的藥時(shí)曲線中直接讀??；藥物濃度大于MIC的時(shí)間占給藥間隔的百分比，是通過(guò)結(jié)合MIC對(duì)組織液中藥物濃度進(jìn)行分析后計(jì)算得到的。

以細(xì)菌變化量(E)為縱坐標(biāo)，分別以PK/PD指數(shù)%T>MIC、Cmax/MIC及AUC/MIC為橫坐標(biāo)，選用WinNonlin中合適的藥效學(xué)模型對(duì)3組數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合后，根據(jù)相關(guān)性得到用于預(yù)測(cè)抗菌效應(yīng)的最佳PK/PD指數(shù)。

運(yùn)用WinNonlin軟件中的抑制性SigmoidEmax模型對(duì)頭孢喹肟的抗菌效應(yīng)與PK/PD指數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，模型方程式為：

(1)

式(1)中，E為抗菌效應(yīng)，是24 h內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的變化值，即△lgCFU/mL；Emax為不含藥對(duì)照組中細(xì)菌量的變化值；E0為藥物與細(xì)菌作用24 h，藥物產(chǎn)生最大抗菌效應(yīng)時(shí)的細(xì)菌變化量；Ce為PK/PD指數(shù)，包括%T>MIC、AUC/MIC和Cmax/MIC；EC50為藥物產(chǎn)生最大抗菌效應(yīng)的50%所需的PK/PD指數(shù)值；N為Hill系數(shù)，表示PK/PD指數(shù)作用的藥效曲線的斜率。

臨床給藥劑量可以整合豬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和體外抗菌試驗(yàn)的結(jié)果，并結(jié)合抑制型SigmoidEmax模型擬合的 Ex-vivo AUC0-24/MIC 值，獲得不同抗菌效果需要的日給藥劑量，計(jì)算公式[7]如下：

(2)

式(2)中，Dose(per day)為日給藥劑量；(AUC/MIC)breakpoint為產(chǎn)生不同抗菌效應(yīng)所需的 Ex-vivo AUC/MIC 臨界點(diǎn)；MIC90為抑制受試細(xì)菌群體90%的菌株所需的 MIC；CLper hour為給藥后每小時(shí)的體清除率；fu為豬血清中的游離藥物分?jǐn)?shù)；F為頭孢喹肟的絕對(duì)生物利用度。

2 結(jié)果與分析

2.1胸膜肺炎放線桿菌在肉湯和血清中的MIC和MBC根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI標(biāo)準(zhǔn)，可知頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌在肉湯和血清中的MIC值均為 0.02 μg/mL，MBC值均為0.032 μg/mL。

2.2靜脈注射和肌內(nèi)注射給藥后頭孢喹肟在豬體內(nèi)的藥物濃度豬單劑量(1 mg/kg )靜脈注射和肌內(nèi)注射給藥后，頭孢喹肟在豬血清的藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用WinNolin 5.2.1 藥動(dòng)學(xué)軟件提供的非房室模型進(jìn)行處理。藥物濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，組織液中藥物濃度在0.5 h左右達(dá)到峰值，在體內(nèi)的消除半衰期更長(zhǎng)。

圖1 單劑量(1 mg/kg)靜脈注射和肌內(nèi)注射頭孢喹肟后豬的藥時(shí)曲線Fig.1 The drug concentration-time curve of pig after single dose (1 mg/kg)of cefquinome by intravenous injection and intramuscular injection

2.3頭孢喹肟在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)通過(guò)靜脈注射和肌內(nèi)注射頭孢喹肟(1 mg/kg)所測(cè)得的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)分別符合二室模型和一級(jí)吸收二室模型，具體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。血清中藥物濃度與時(shí)間的關(guān)系式如下：C=Ae-αt+Be-βt，C=Ae-αt+Be-βt-(A+B)e-kat。

表1靜脈注射和肌內(nèi)注射頭孢喹肟(1mg/kg)后血清中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

Table1Thepharmacokineticparametersintheserumaftersingledose(1mg/kg)ofcefquinomebyintravenousinjectionandintramuscularinjection

注射方式InjectionmethodsA∥mg/Lα∥h-1B∥mg/Lβ∥h-1Ka∥h-1V∥L/kg靜脈注射Intravenousinjection3．61±0．589．25±1．272．17±0．380．62±0．080．25±0．09肌內(nèi)注射Intramuscularinjection1．83±0．511．21±0．430．83±0．210．42±0．0913．21±2．780．46±0．07注射方式Injectionmethodst1/2α∥/ht1/2β∥ht1/2Ka∥hK10∥h-1K12∥h-1K21∥h-1靜脈注射Intravenousinjection0．16±0．041．52±0．433．35±0．874．87±1．533．23±0．81肌內(nèi)注射Intramuscularinjection0．78±0．252．76±0．460．08±0．020．58±0．210．55±0．090．21±0．04注射方式InjectionmethodsCL∥L/(kg·h)Cmax∥μg/mLTmax∥hAUC0～24∥(μg·h)/mLF∥%靜脈注射Intravenousinjection0．28±0．07肌內(nèi)注射Intramuscularinjection0．24±0．030．237±0．0560．31±0．083．8±0．68104．57±11．28

2.4頭孢喹肟在血清中的靜態(tài)殺菌動(dòng)力學(xué)曲線從圖2可以看出，頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌具有明顯的抗菌活性，并且隨著藥物濃度的增加，頭孢喹肟的抗菌效應(yīng)增強(qiáng)。在血清中，經(jīng)過(guò)2 h的培養(yǎng)，菌液濃度已呈梯度性變化，0.5 MIC時(shí)無(wú)明顯的抑菌效應(yīng)，1.0 MIC時(shí)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用，當(dāng)濃度大于2.0 MIC時(shí)呈現(xiàn)殺菌效應(yīng)，并且濃度越大，殺菌速率越快；當(dāng)濃度超過(guò)4.0 MIC時(shí)，細(xì)菌數(shù)量下降幅度不大。

圖2 頭孢喹肟在血清中對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌效應(yīng)Fig.2 The antibacterial effect of cefquinome in the serum on Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro

2.5半體內(nèi)模型中頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的抗菌效應(yīng)肌內(nèi)注射和靜脈注射頭孢喹肟(1 mg/kg)后，在11個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的豬血清中頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的半體內(nèi)抗菌效應(yīng)分別見(jiàn)圖3和圖4。從圖3和圖4可以看出，肌肉注射后，在0～6 h內(nèi)采集的血清樣品能夠達(dá)到清除效應(yīng)作用(細(xì)菌濃度下降1×104CFU/mL)；8 h采集的血清樣品，可達(dá)到殺菌效應(yīng)(細(xì)菌濃度下降1×103CFU/mL)；12 h后細(xì)菌數(shù)量低于檢測(cè)限。12 h采集的血清樣品可達(dá)到抑菌作用。靜注后，在0～8 h內(nèi)采集的血清樣品均具有清除效應(yīng)。12 h后，細(xì)菌數(shù)量低于檢測(cè)限。12 h采集的血清樣品，可達(dá)到抑菌作用。

圖3 肌內(nèi)注射頭孢喹肟(1 mg/kg)后體外24 h殺菌曲線Fig.3 The bactericidal curve in vitro after intramuscular injection of 1 mg/kg cefquinome 24 h

圖4 靜脈注射頭孢喹肟(1 mg/kg)后體外24 h殺菌曲線Fig.4 The bactericidal curve in vitro after intravenous injection of 1 mg/kg cefquinome 24 h

2.6頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的PK/PD關(guān)系頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的PK/PD指數(shù)之間的關(guān)系見(jiàn)圖5。由圖5可知，血清中PK/PD指數(shù)AUC0-24/MIC和Cmax/MIC與細(xì)菌變化量E的擬合效果均良好。由相關(guān)系數(shù)R2可知，AUC0-24/MIC (R2=0.9967)是預(yù)測(cè)頭孢喹肟的抗菌效應(yīng)最合適的PK/PD指數(shù)。分別產(chǎn)生抑菌、抗菌和清除的效應(yīng)時(shí)，相對(duì)應(yīng)的AUC0-24/MIC分別為116.0、175.5和218.5。

圖5 PK/PD參數(shù)與細(xì)菌變化量(E)的關(guān)系Fig.5 The relationship between PK/PD parameters and variable quantity of bacteria

3 討論與結(jié)論

目前，頭孢喹肟的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)在豬、牛[8]等動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了研究。該試驗(yàn)結(jié)果表明，肌內(nèi)注射硫酸頭孢喹肟符合一級(jí)吸收二室模型，其主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下：血藥達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為0.31 h，峰濃度(Cmax)為0.237 μg/mL，t1/2β為2.76 h，AUC0-24為3.8(μg·h)/mL 與楊大偉等[9]研究結(jié)果相一致。但是，該試驗(yàn)測(cè)得的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)與劉利鋒等[10]的數(shù)據(jù)存在差異，這可能是由于動(dòng)物的大小或者頭孢喹肟的生產(chǎn)廠家的工藝的不同造成的。

測(cè)定在不同培養(yǎng)介質(zhì)的條件下，藥物對(duì)細(xì)菌體外的MIC和MBC值，對(duì)研究藥動(dòng)/藥效學(xué)同步模型具有重要的意義。Shan等[11]研究發(fā)現(xiàn)在不同的基質(zhì)中，能夠引起MIC和MBC不一致，結(jié)果表明頭孢喹肟在血清、組織液和炎癥滲出液對(duì)多殺性巴氏桿菌的MIC和MBC比MH肉湯中高 3 倍左右。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)頭孢喹肟在MHB和血清中對(duì)大腸桿菌的MIC值分別為 0.030和0.032 μg/mL，MBC值分別為0.060和0.064 μg/mL，基質(zhì)效應(yīng)無(wú)明顯差異。該試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌在肉湯和血清中的MIC和MBC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論在肉湯還是血清中，頭孢喹肟對(duì)胸膜肺炎放線桿菌均具有相同的抗菌活性。這些研究結(jié)果對(duì)于治療胸膜肺炎放線桿菌有著一定的指導(dǎo)作用。但是，如果測(cè)定體內(nèi)的MIC和MBC,可能會(huì)對(duì)臨床具有更合理的指導(dǎo)作用。

半體內(nèi)PK/PD模型屬于PK/PD 研究的一種有效方法，可為臨床疾病的治療提供一定的合理建議。頭孢喹肟屬于時(shí)間依賴性藥物，其最有預(yù)測(cè)效果的 PK/PD 的參數(shù)是%T>MIC[13]，但是由于在半體內(nèi)研究中藥物的濃度是恒定不變的，因此，獲得%T>MIC的意義不大。因此 選擇測(cè)定AUC0-24/MIC 來(lái)擬合數(shù)據(jù)。該試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)AUC0-24/MIC達(dá)到116.0、175.5和218.5時(shí)，細(xì)菌變化量E分別下降2 lgCFU/mL、3 lgCFU/mL和4 lgCFU/mL。參考上述公式，細(xì)菌變化量E下降2 lg CFU/mL、3 lg CFU/mL和4 lg CFU/mL所需每天的給藥劑量分別為0.56、0.84和1.0 mg/kg。因此，當(dāng)頸部肌內(nèi)注射硫酸頭孢喹肟(1.0 mg/kg)，可達(dá)到清除細(xì)菌的效果。

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