邵迎春，左志晗*，尚碧嬌，耿緒云，董學旺

(1.天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津 300221)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)由于適應鹽度廣泛，在我國水產養(yǎng)殖業(yè)中占有很大的比例。隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，凡納濱對蝦病害日益嚴重，抗生素成為傳統(tǒng)的首選解決途徑[1]。然而，使用過量的抗生素不僅會對對蝦腸道的正常菌群結構產生破壞作用，而且容易導致病原菌產生耐藥性，耐藥菌株經(jīng)過水體或對蝦進入人體，最終危害人體健康，這些現(xiàn)象已引起人們的高度關注[2]。基于細菌在生物種群中的重要作用及地位[3]，許多學者將有活性的益生菌作為添加劑添加到飼料中，通過維持腸道菌群平衡來提高動物免疫力，進而起到防病抗病的效果[4]。由于益生菌在水生生物體內既不會出現(xiàn)耐藥性也不會產生殘留，所以益生菌替代抗生素已成為眾多學者的研究熱點[5]。研究表明，在飼料中添加益生菌不僅可以促進水生動物快速生長，提高存活率，而且可以通過增強水生動物的免疫力來降低疾病的發(fā)生率[6-9]。

益生菌的作用機理是建立有機體腸道內微生物群系，保護有機體免疫系統(tǒng)，進而提高有機體免疫力，增強有機體消化吸收能力?；谝嫔纳鲜鲎饔脵C理，筆者將益生菌的初步篩選主要集中在對對蝦常見致病菌的拮抗能力和產消化酶特性上，即從健康的凡納濱對蝦腸道內分離并篩選出具有抑菌活性且能分泌消化酶活性的菌株[10-11]。通過對篩選出的活性候選菌株進行藥敏試驗和溶血試驗，確定其生物安全性，并對最終篩選出的菌株進行分類與鑒定，以期為對蝦益生菌制劑的研發(fā)及應用奠定基礎，促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1試驗材料健康凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)由天津市興盛水產公司提供，試驗中使用的2216E培養(yǎng)基參考 Furniss等[12]的方法進行配制，芽孢桿菌分離培養(yǎng)基、芽孢桿菌富集培養(yǎng)基、脂肪培養(yǎng)基、脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基的制備參考試驗技術手冊上的制備方法[13]，淀粉培養(yǎng)基的制備參考Castro等[14]的方法，九鹽溶液(NSS)的配制參照Olsson等[15]的方法， MRS、 LBS、YPD、高氏一號培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司，Biolog Gen Ⅲ鑒定板購自華粵企業(yè)集團有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1凡納濱對蝦腸道細菌的分離。 凡納濱對蝦腸道細菌的分離參考Kongnum等[16]的方法并稍做改良。試驗于無菌條件下進行，取對蝦腸道置于滅菌勻漿器中，冰浴研磨，用九鹽溶液將研磨液進行10-1至10-8的梯度稀釋。分別取梯度10-3至10-7的稀釋液100 μL涂布于 LBS培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基上，每組設置3個平行；分離芽孢桿菌前，首先應將研磨液在芽孢桿菌的富集培養(yǎng)基中28 ℃下培養(yǎng)18～24 h，然后置于80 ℃水浴中加熱15 min，分別用加熱后的10-7～10-3的梯度稀釋液100 μL涂在芽孢桿菌固體分離培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h；多次劃線純化。

1.2.2抑菌活性菌株的篩選。采用濾紙片法[17]進行抑菌活性菌株的篩選并稍做改良。使用相應的液體培養(yǎng)基將“1.2.1”中純化的菌株接種，在振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)24 h；同時，取實驗室保存的6種常見水產致病菌[大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)]的甘油保存菌液100 μL接種到1 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6左右；取活化培養(yǎng)的致病菌100 μL 均勻涂布在TSB固體培養(yǎng)基上，靜置30 min后，用無菌鑷子將滅菌的濾紙片貼在TSB固體培養(yǎng)基上；用移液器取待測菌液各5 μL滴加到濾紙片上，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h；測量待測菌株產生的抑菌圈直徑，將篩選出的菌株進行重復試驗，確保篩選出的菌株具有穩(wěn)定的拮抗特性。

1.2.3產消化酶活性菌株的篩選。將“1.2.2”中篩選到的具有拮抗特性的各菌株活化培養(yǎng)為固體菌后分別點種于脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和脂肪培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，根據(jù)菌落能否產生蛋白水解圈、淀粉水解圈和紅斑篩選出能分泌體外消化酶的菌株。

1.2.4菌株溶血活性的測定。參照Orsod等[18]和Santos等[19]的方法，以金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分別為陽性對照和陰性對照，用無菌竹簽挑取測試菌株點種在含5%鯽魚血的2216E瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀測有無溶血環(huán)產生并記錄溶血環(huán)的直徑。

1.2.5藥敏試驗。采用紙片瓊脂擴散法[20]進行藥敏試驗。每種抗生素紙片均設置3個重復，用2株已知抗生素耐藥性的標準菌株金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923)和大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)作為陽性質控菌。培養(yǎng)結束后，依據(jù)透明圈直徑的大小判定抗生素的藥敏性，參照WHO提供的NCCLS標準[13]。

1.2.6候選益生菌的鑒定。 首先對最終篩選出的候選益生菌株進行16S rDNA分子生物學鑒定。分別提取候選益生菌菌株總DNA，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增其16S rDNA片段。PCR反應程序如下：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min; 4 ℃保溫。將擴增產物(1.5 kb左右)交由北京金維智科技有限公司進行測序， 將測序后的序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行Blast比對鑒定。

此外，為確保分子生物學鑒定結果的準確性和可靠性，還進行了Biolog系統(tǒng)鑒定。在相應的固體培養(yǎng)基上按照常規(guī)方法劃線，培養(yǎng)出需要鑒定的純種候選益生菌，再用滅菌的一次性棉簽將分離純化的菌株接到接種液中，配制成指定渾濁度的菌懸液。將菌懸液(每孔100 μL)加入GenⅢ鑒定板中培養(yǎng)。培養(yǎng)后，培養(yǎng)板呈現(xiàn)不同程度的紫色，代表表型指紋，將表型指紋與 Biolog系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)進行比對，進而使所分離的微生物在生化水平上得到鑒定。

2 結果與分析

2.1菌株的初步篩選采用九鹽溶液配制的MRS培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、芽孢桿菌分離培養(yǎng)基分離菌株。其中，從MRS培養(yǎng)基上分離純化到157株，從LBS培養(yǎng)基上分離純化到140株，從高氏一號培養(yǎng)基上分離純化到135株，從YPD培養(yǎng)基分離純化到263株，從2216E培養(yǎng)基上分離純化到259株，從芽孢桿菌分離培養(yǎng)基上分離純化到266株，共分離出1 220株菌株。利用常見的6種致病菌、脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、脂肪培養(yǎng)基對這些分離純化的菌株進行初步篩選，經(jīng)篩選后得到13株兼具抑菌活性、分解蛋白質、淀粉和脂肪活性的候選益生菌，其分解結果產生的現(xiàn)象，如圖1所示。

注：A.拮抗斑；B.蛋白酶陽性；C.淀粉酶陽性；D.脂肪酶陽性Note：A.The antagonistic spot were seen;B.Protease detection results were positive;C.Amylase detection results were positive;D.Lipase detection results were positive圖1 菌株的抑菌活性及消化酶活性Fig.1 Antimicrobial activity and digestive enzyme activity of strains

2.2菌株的溶血性對獲得的13株兼具抑菌活性及產消化酶活性的菌株進行溶血活性的測定，結果發(fā)現(xiàn)12號和13號菌株具有溶血現(xiàn)象，表明其具有潛在的致病性，因此不考慮作為候選菌株，其余菌株均不具有溶血現(xiàn)象。

2.3菌株的藥敏試驗結果對分離到的13株兼具抑菌活性及產消化酶活性的菌株進行抗生素的藥敏試驗，依照 WHO提供的 NCCLS最新版本，對被測菌株的敏感性進行判定，得到各菌株對常用抗生素的敏感性結果。由表1可知，1、2、4、5、7、8、9、10、11號菌株對抗生素具有較強的抗性， 不考慮作為候選益生菌；3、6號菌株對抗生素的敏感性強，抑菌活性及消化酶活性較高，因此初步確定為候選益生菌，用于進行后續(xù)試驗。

表1 各菌株的藥敏試驗結果

注：R.耐藥；I.中度敏感；S.敏感

Note：R.resistant; I.intermediate; S.sensitive

2.4候選益生菌株的鑒定比較抑菌試驗、消化酶試驗、溶血性試驗、藥敏試驗結果，最終選取3號和6號菌株為候選益生菌，并對其進行16S rDNA分子鑒定以及 Biolog鑒定。 將測得菌16S rDNA序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行 Blast序列比對，比對結果表明3號細菌與霍氏腸桿菌(EnterobacterhormaecheistrainWW2， JN993998.1)相似性達到98%，6號細菌與乳酸菌(Lactic acid bacterium ZJGS0109， KC748440.1)相似性達到100%。Biolog系統(tǒng)鑒定結果與分子生物學鑒定結果相一致，說明該鑒定結果可靠。

3 討論與結論

益生菌在畜牧業(yè)、人類、農業(yè)等方面的應用發(fā)展較迅速，但在水產業(yè)中的應用起步較晚。目前，應用較多的益生菌主要有硝化細菌、芽孢桿菌、假單胞菌、光合細菌、雙歧桿菌等。農業(yè)部對何種微生物可以作為益生菌應用并沒有明確規(guī)定。芽孢桿菌是水產養(yǎng)殖中應用最廣泛的益生菌之一，其作用機理是通過抑制病原菌的生長來降低病原菌的致病性，從而提高水產動物的抗病力[21]。益生菌產生的消化酶，能夠顯著提高養(yǎng)殖水產動物對飼料的利用率，促進水產動物的快速生長[22]。當凡納濱對蝦受到病原菌或病毒侵害時，對蝦會促使非特異性免疫系統(tǒng)啟動，表達相關免疫物質(如超氧化物歧化酶、酚氧化酶、溶菌酶等)抵抗病原菌或病毒，但僅靠非特異性免疫系統(tǒng)，通常不能完全抑制病原菌或病毒，這是因為對蝦沒有特異性免疫。已有研究表明，當對蝦受到外來病原菌或病毒侵害時，與未使用益生菌的對蝦相比，使用添加益生菌的飼料飼喂對蝦可以產生更多的免疫物質來保護對蝦[23]。因此，筆者從健康水生動物體內分離具有拮抗致病菌能力，產消化酶能力的菌株是篩選益生菌的有效參考依據(jù)。

篩選益生菌以抑菌試驗和消化酶試驗為參考依據(jù)，還要考慮菌株的安全性，同時要顧及益生菌制劑的使用目的和作用對象[24]。候選益生菌株是否具有較強的抗藥性，能否產生溶血現(xiàn)象，是不可忽視的安全性問題。研究表明，被水生動物攝入到體內的抗生素，大多數(shù)會以母體化合物的形式釋放到養(yǎng)殖水體中，致使水生生物體內和環(huán)境介質中出現(xiàn)抗藥性菌株[25]。據(jù)報道，從我國地表水中已檢測出超過60種抗生素抗性基因[26]，在世界各水體、沉積物中被高頻率地檢測出16種抗生素抗性基因[27-28]?？股氐拈L期使用，造成環(huán)境中微生物產生選擇性壓力，誘導動物體內產生抗生素抗性基因。這種抗性基因可以通過多種方式(例如質粒交換等)進行傳播，抗生素的過度使用使細菌的抗藥性由單一性快速發(fā)展為多重性[29]。因此，菌株的藥敏試驗是衡量其安全性的重要參考依據(jù)之一。該研究結合候選菌株的溶血試驗和藥敏試驗結果評價了候選菌株的安全性，結果發(fā)現(xiàn)部分候選菌株具有很強的抗藥性，抗生素在水產養(yǎng)殖業(yè)中的高頻率使用是導致養(yǎng)殖動物體內菌株產生抗藥性的主要原因，并將導致水環(huán)境中微生物產生抗藥性以及食品安全等問題。此外，在進行溶血試驗時部分菌株表現(xiàn)出較強的溶血活性，具有威脅人類健康的潛在致病性，因此也不考慮作為益生菌株。

筆者通過對凡納濱對蝦腸道中微生物進行分離，體外篩選具有拮抗常見病原菌能力、分解蛋白質、脂肪及淀粉能力的菌株，并通過拮抗能力、產酶能力比較和安全性評價，最終獲得2株具有抑制多種水產病原菌活性及消化酶活性的候選益生菌。

該研究對最后篩選出的2株候選益生菌進行了分子生物學鑒定以及Biolog系統(tǒng)鑒定。16S rDNA 基因作為分子指標，運用于分子生物學鑒定中，可以對各類細菌和真菌等進行快速、微量分類與鑒定。但是，單一應用16S rDNA的方法對菌株進行鑒定可能無法得出準確結論，因此該研究結合 Biolog系統(tǒng)鑒定法對候選益生菌進行了生理生化水平鑒定，結果發(fā)現(xiàn)2種方法鑒定結果一致，2株候選益生菌經(jīng)鑒定分別為霍氏腸桿菌和乳酸菌，說明鑒定結果準確、可靠。該研究為今后凡納濱對蝦益生菌制劑的開發(fā)和應用建立了一種有效的篩選及鑒定方法。

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