武昌俊，李 舜，蔡 標，戴陳偉，王 超，馬 征，周秀紅，童 琳

(安徽省醫(yī)學科學研究院，安徽合肥 230001)

目前，家畜病源菌主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌等。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，能導(dǎo)致家畜急性胃腸炎和腹瀉癥狀的發(fā)生[1]，如能引起仔豬大腸桿菌性腹瀉，導(dǎo)致黃痢、白痢、斷奶仔豬腹瀉及仔豬水腫等疾病[2]，還能引起雞大腸桿菌病，導(dǎo)致雞心包炎、肝周炎、敗血癥等多種疾病[3]。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，是引起家豬食物中毒的常見致病菌[4]。白色念珠菌屬于真菌類，通過感染人和動物，在體內(nèi)增殖并形成侵襲性真菌感染，導(dǎo)致人和動物嚴重感染甚至死亡[5]。目前，消毒劑已被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖區(qū)的棚舍、飼養(yǎng)工具和飼料貯存等常規(guī)消毒滅菌工作中[6]。消毒劑是指能夠殺滅或抑制傳播媒介中的病原微生物的制劑，能夠切斷傳染病的傳播途徑，達到控制傳染病的目的[7]。目前，市場上動物飼養(yǎng)消毒劑有很多種。筆者研究了一種0.5%聚維酮碘消毒劑的消毒效果和刺激性。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株。大腸桿菌(ATCC8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、白色念珠菌(ATCC10231)，均購自安徽艾浮地艾空氣凈化檢測站，來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2實驗動物。多次皮膚刺激試驗選用健康豚鼠5只，體質(zhì)量250～300 g，購自南京安立默科技有限公司，合格證號為0016470。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗選用健康豚鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，購自南京安立默科技有限公司，合格證號為0016492。

1.1.3培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的培養(yǎng))、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(用于白色念珠菌的培養(yǎng))，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.4試劑。試驗用消毒劑為一種含0.5%(W/V)聚維酮碘的深褐色澄清液體，pH 2.8。細菌殺滅試驗所用中和劑為含1%(W/V)硫代硫酸鈉+1%(W/V)卵磷脂+1%(W/V)吐溫-80的0.03 mol/L PBS溶液。有機干擾物為30 g/L牛血清白蛋白。

1.2供試菌株的活化接種供試菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌至相應(yīng)瓊脂試管斜面培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h。每個菌種各取2支斜面供試驗用，其余菌種冷藏備用。

1.3菌懸液的制備挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌斜面菌落，分別接種至相應(yīng)的瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h至對數(shù)生長期，無菌生理鹽水洗脫菌落，分別制成菌液濃度為107～108CFU/mL的菌懸液，備用。

1.4中和劑鑒定試驗試驗選擇金黃色葡萄球菌(細菌)和白色念珠菌(真菌)進行中和劑鑒定試驗[8]。試驗分為6組，分別為：①(消毒劑+菌懸液)、②[(消毒劑+菌懸液)+中和劑]、③(中和劑+菌懸液)、④[(消毒劑+中和劑)+菌懸液]、⑤(稀釋液+菌懸液)、⑥(稀釋液+培養(yǎng)基+中和劑)。具體試驗步驟按照《消毒技術(shù)規(guī)范》衛(wèi)生部2002版中懸液定量殺菌試驗程序進行。⑥組平板菌落數(shù)應(yīng)為0；①組平板菌落數(shù)應(yīng)為0，或僅有極少；②組平板菌落數(shù)應(yīng)比①組多，但應(yīng)比③、④、⑤組少；③、④、⑤組菌落數(shù)誤差率應(yīng)不高于15%。試驗重復(fù)3次，均符合要求時，判定所選中和劑及其濃度為受試樣品殺菌試驗適宜的中和劑。

1.5懸液定量殺菌試驗在無菌試管內(nèi)分別加入0.5 mL菌懸液和0.5 mL有機干擾物溶液，再加入受試消毒劑殺菌工作濃度1.25倍的消毒劑(陽性對照為胰蛋白胨生理鹽水溶液)，快速混勻。分別作用至設(shè)定時間，取混合液0.5 mL加入裝有4.5 mL中和劑溶液的試管內(nèi)，混勻作用10 min，中和殺菌反應(yīng)。選取稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基作為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)48 h，試驗于19～21 ℃水浴條件下進行，重復(fù)3次。觀察試驗結(jié)果，稀釋涂平板并計算各組的菌濃度(CFU/mL)，換算成對數(shù)值，殺滅對數(shù)值按以下公式計算[8]：平均殺滅對數(shù)值=陽性對照組平均菌濃度對數(shù)值-試驗組平均菌濃度對數(shù)值。

1.6多次皮膚刺激試驗取皮膚正常、完好的健康白色豚鼠5只，試驗前24 h背脊部兩側(cè)各約3 cm×3 cm備皮。將受試消毒劑原液均勻涂在一側(cè)脫毛皮區(qū)，用用無刺激性塑料膜覆蓋表面，用無刺激性膠布和繃帶加以固定，另一側(cè)脫毛皮區(qū)無處理，作為陰性對照。4 h后溫水洗凈殘留消毒劑。每天試驗處理1次，連續(xù)試驗14 d。在每次試驗后24 h觀察皮膚刺激反應(yīng)并進行評分。

1.7皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗取皮膚正常完好的健康白色豚鼠48只，雌雄各半，隨機分成3組，分別為試驗組、陽性對照組和陰性對照組，每組各16只，雌雄各半。試驗前24 h背脊部左側(cè)約3 cm×3 cm備皮。24 h后進行誘導(dǎo)試驗。①試驗組。取0.5 mL受試消毒劑原液均勻涂在左側(cè)脫毛皮區(qū)，用無刺激性塑料膜覆蓋表面，用無刺激性膠布和繃帶加以固定，持續(xù)6 h。②陽性對照組。取0.5 mL 1%2，4-二硝基氯苯溶液均勻涂在脫毛皮區(qū)，用無刺激性塑料膜覆蓋表面，用無刺激性膠布和繃帶加以固定，持續(xù)6 h。③陰性對照組。暫不做誘導(dǎo)試驗，正常飼養(yǎng)。6 h后，將試驗組和陽性對照組脫毛皮區(qū)清水洗凈，回籠正常飼養(yǎng)。第7和14天采用同樣方式給藥1次，在末次給藥后14 d進行激發(fā)試驗，試驗前24 h將豚鼠背脊部右側(cè)約3 cm×3 cm備皮。試驗組將受試消毒劑原液均勻涂在右側(cè)脫毛皮區(qū)，用無刺激性塑料膜覆蓋表面，用無刺激性膠布和繃帶加以固定，持續(xù)6 h；陽性對照組，取0.5 mL 0.1%2，4-二硝基氯苯溶液均勻涂在脫毛皮區(qū)，用無刺激性塑料膜覆蓋表面，用無刺激性膠布和繃帶加以固定，持續(xù)6 h；陰性對照組，給藥方式、范圍與試驗組相同，給藥后6 h清水將給藥處皮膚洗凈。24和48 h后觀察皮膚反應(yīng)，按皮膚反應(yīng)和致敏強度分級標準進行評定。將出現(xiàn)皮膚反應(yīng)(出現(xiàn)紅斑和水腫)的動物數(shù)除以該組動物數(shù)，得到致敏率(%)，按照相關(guān)標準評定致敏強度。

2 結(jié)果與分析

2.1中和劑鑒定試驗結(jié)果該試驗的中和劑鑒定選用含1%(W/V)硫代硫酸鈉+1%(W/V)卵磷脂+1%(W/V)吐溫-80的0.03 mol/L PBS溶液的中和劑。以金黃色葡萄球菌作為試驗菌株，①和⑥組沒有菌落生長；②組有少量菌落生長；③、④、⑤組均有大量菌落生長，平均生長菌落數(shù)均在2.0×107CFU/mL。以白色念珠菌作為試驗菌株，①和⑥組沒有菌落生長；②組有少量菌落生長；③、④、⑤組均有大量菌落生長，平均生長菌落數(shù)為1.5×107～1.7×107CFU/mL。中和劑鑒定試驗結(jié)果表明，該試驗所選用的中和劑對該消毒劑殺滅細菌和真菌起中和作用，且中和劑及中和產(chǎn)物對試驗菌株及培養(yǎng)基無影響。

2.2懸液定量殺滅試驗結(jié)果由表1可知，該消毒劑對懸液內(nèi)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作用1、2和3 min，平均殺滅對數(shù)值均大于5；對白色念珠菌分別作用1、2、3 min，平均殺滅對數(shù)值均大于4，表明該0.5%聚維酮碘消毒劑對革蘭氏陽性菌和陰性菌的殺滅效果快速高效，其中對真菌的殺滅效果較好，該0.5%聚維酮碘消毒劑對細菌繁殖體和真菌具有良好的殺滅效果。

表1 0.5%聚維酮碘消毒劑的殺菌試驗結(jié)果

注：陰性對照無菌落生長

Note：There was no colony growth in negative control

2.3多次皮膚刺激試驗結(jié)果多次皮膚刺激試驗結(jié)果表明，該0.5%聚維酮碘消毒劑原液對豚鼠完整皮膚連續(xù)涂抹14 d后，未見皮膚紅斑、水腫等異常反應(yīng)，其皮膚刺激性指數(shù)為0，對豚鼠皮膚無刺激性。

2.4皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果表明，該0.5%聚維酮碘消毒劑原液連續(xù)對豚鼠皮膚進行誘導(dǎo)試驗和激發(fā)試驗各6 h后，試驗組動物皮膚致敏率為0，致敏強度為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

聚維酮碘又名碘伏，是有效碘與一類表面活性劑聚乙烯吡略烷酮相結(jié)合而形成的一種絡(luò)合物[9]。聚維酮碘具有毒性低、殺菌作用持久、價格相對低廉、對皮膚黏膜無刺激、毒副作用小等特點，是一種高效、廣譜的新型消毒劑，對細菌和芽孢等具有較強的殺滅作用[10-11]。羅延智等[12]研究表明使用聚維酮碘對志愿者前臂內(nèi)側(cè)中段皮膚表面擦拭消毒后，對皮膚表面自然菌的殺滅效果符合我國消毒規(guī)范要求。

聚維酮碘的殺菌作用機制是碘元素能夠直接快速地鹵化菌體蛋白，有效沉淀菌體蛋白，此外聚維酮碘還具有一定的穿透和氧化微生物細胞壁的功能，碘能在游離狀態(tài)下替代微生物細胞中的自身內(nèi)容物，從而能夠有效殺滅微生物[13]。

該研究結(jié)果表明，該0.5%聚維酮碘消毒劑對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作用1、2和3 min，平均殺滅對數(shù)值均大于5，對細菌的殺滅效果快速高效；對白色念珠菌分別作用1、2和3 min，平均殺滅對數(shù)值均大于4，對真菌的殺滅效果較好。皮膚的刺激性指數(shù)為0，對豚鼠完整皮膚刺激強度為無刺激性。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果表明，試驗組動物皮膚致敏率為0，致敏強度為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)。該0.5%聚維酮碘消毒劑對細菌繁殖體和真菌具有良好的殺滅性能，對人和動物安全無刺激。

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