趙光輝，常文越，劉 智，張依然，馬珊珊

(1.沈陽環(huán)境科學研究院，遼寧沈陽 110167;2.遼寧省城市生態(tài)重點實驗室，遼寧沈陽 110167；3.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016；4.中國科學院大學，北京 100049)

渾河沈陽段又名沈水，對沈陽市的地下水補給、景觀、農(nóng)灌、泄洪及城市生態(tài)環(huán)境調(diào)節(jié)起著不可替代的作用。目前，隨著工業(yè)和技術的進步與發(fā)展，各類污染物通過一系列途徑進入水體環(huán)境，對環(huán)境中的生物體產(chǎn)生極大影響，對生態(tài)系統(tǒng)的平衡造成嚴重威脅。近年來，關于渾河的相關研究主要包括渾河流域重金屬的含量、分布狀況及來源的研究以及渾河流域沉積物中重金屬分布特征及對底棲動物的影響研究[1-3]。而關于渾河水環(huán)境重金屬對水生生物的生態(tài)健康影響的研究還相對較少，尤其是對魚類等水生生物的生態(tài)毒理的研究相對較少。

魚類對水體環(huán)境的變化十分敏感，因而被廣泛用于水體污染物的監(jiān)測及評價中。斑馬魚(Daniorerio)作為研究水體的模式生物，其特點主要有：體型小，對飼養(yǎng)水質(zhì)要求不高，繁殖周期短，易飼養(yǎng)及獲取，對微量污染物反應靈敏[4]。當魚體所處的水環(huán)境受污染物影響時，魚體內(nèi)的抗氧化機制被充分調(diào)動，進而保護機體自身免受過量活性氧的損傷。其中，重要的抗氧化因子包括超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)[5]。丙二醛(MDA)可以指示機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度[6]。另外，乙酰膽堿酯酶(AChE)是水生生物神經(jīng)毒性效應的重要標志物[7]?？偪寡趸芰?T-AOC)代表在受到脅迫后，機體的防御能力[8]。Na+/K+-ATPase是一項廣泛用于評價污染壓力的參數(shù)[9]。相關文獻報道，污染物與生物體自由基的產(chǎn)生、自由基清除系統(tǒng)的激活、谷胱甘肽代謝等存在必然聯(lián)系，以上指標被認為是快速靈敏反映環(huán)境脅迫對生物體影響的生物標志物，被廣泛應用于水體生態(tài)毒理研究及生態(tài)污染風險評價中，在診斷環(huán)境污染問題中發(fā)揮著重要作用[4]。筆者選用斑馬魚作為試驗生物，在取樣測定渾河水樣金屬元素含量的基礎上，研究了水體重金屬對斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織的SOD、CAT、GSH、GST、MDA、AChE、T-AOC以及Na+/K+-ATPase活性的影響，旨在篩選敏感的生物標記物，為分析評估水體綜合影響與生態(tài)系統(tǒng)健康提供毒理學數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。斑馬魚平均體長為(2.13±0.06)cm，平均體重為(105.42±8.00)mg。試驗前暫養(yǎng)7 d，使其適應實驗室環(huán)境，每天投喂基礎飼料2次，連續(xù)曝氣。光暗周期比為16∶8 h，水溫為(24±2)℃，pH 7.6～8.0，溶解氧 >8 mg/L，硬度以CaCO3計為(250±25)mg/L。養(yǎng)殖期間，斑馬魚活動正常，無病，死亡率低于3%。

1.1.2試劑。SOD、GSH、GST、CAT、MDA、AChE、T-AOC和Na+K+-ATPase試劑盒均購自南京建成生物工程研究所[10-14]。

1.2方法

1.2.1試驗設計。試驗對照組用水為經(jīng)過24 h自然曝氣的自來水，處理組用水為定期采集的渾河水(五里河公園，地理坐標為123.45E、41.76N)。每組設置3個魚箱(0.4 m×0.4 m×0.6 m)作為重復。每箱放斑馬魚100尾，試驗期間每7 d換1次水，脅迫時間為90 d。

1.2.2樣品采集與處理。采用常規(guī)解剖方法獲取斑馬魚的腦、鰓、肝、腸、肌肉等組織樣品。由于斑馬魚體型較小，為便于分析，將10尾魚合并為1個樣品進行分析測定。

渾河水樣及斑馬魚組織樣品的消解均在消解爐上進行。Al、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn金屬元素的測定使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)。測定過程中嚴格遵守方法的有效性及質(zhì)量控制，樣品加標回收后誤差范圍在±10%內(nèi)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計所得的數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean ± SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本T-test分析。

2 結果與分析

2.1水體中重金屬元素含量渾河沈陽城市段水體中各金屬元素含量見表1。獨立樣本T-test分析結果顯示，渾河水與對照水相比，Cu、Fe、Mn、Zn含量差異顯著。渾河水中Cu、Fe、Mn、Zn含量均值分別為0.01、0.295、0.064、0.104 mg/L，符合中國地表水環(huán)境質(zhì)量 Ⅱ 類水質(zhì)標準(Fe和Mn符合集中式生活飲用水地表水源地補充項目標準限值)。但與對照組相比，Cu、Fe、Mn、Zn含量分別高出42.9%、217.2%、77.8%和96.2%。

2.2斑馬魚各組織中的重金屬元素累積量斑馬魚不同組織中的重金屬元素累積量見表2。由于不同金屬對生物體生命作用的不同，斑馬魚各組織中各類金屬含量差異不同。除肌肉組織外，各重金屬元素含量為：Fe>Zn>Mn>Cu。由于魚體內(nèi)各組織器官生理功能和代謝水平存在差異，對于同一種金屬而言，在不同組織中的含量也存在顯著差異。Cu在斑馬魚組織中的含量為：肝>腸>腦>鰓>肌肉。Fe在斑馬魚組織中的含量為：肝>腸>鰓>腦>肌肉。Mn在斑馬魚組織中的含量為：肝>鰓>肌肉>腦>腸。Zn在斑馬魚組織中的含量為：肌肉>肝>鰓>腸>腦。

對于Cu、Fe、Mn、Zn來說，累積的主要組織是斑馬魚的肝組織。渾河水養(yǎng)殖的斑馬魚肝組織中Cu、Fe、Mn、Zn含量分別是對照組的1.6倍、1.9倍、5.5倍和1.5倍。肝臟是魚的消化和代謝器官，對重金屬的代謝起著非常重要的作用。因為肝臟的解毒作用，組織內(nèi)可誘導產(chǎn)生大量束縛金屬的金屬硫蛋白MT，使肝成為體內(nèi)蓄積金屬的主要部位[15]。影響重金屬在生物體內(nèi)累積的因素很多，包括重金屬元素的性質(zhì)、生物種類、生物發(fā)育的不同階段以及食物鏈等對生物累積均有不同程度的影響。在同等條件下，重金屬元素的性質(zhì)對生物的影響往往十分明顯，有些重金屬對某些組織具有較高的親和性，或與某些內(nèi)源性物質(zhì)(如蛋白質(zhì)或多肽)結合性高，可以較長時期存留在生物組織內(nèi)，并在一定時間內(nèi)不斷積累增多。例如，Paulami等[16]研究了Cu、Zn、Cd、Pb 和Cr 在尼羅羅非魚肌肉、魚卵、腎臟、肝臟、魚鰓和魚鰭中的累積。結果表明，Pb 和Cd 在所有的組織器官累積量都無顯著差異，具有相似的累積模式。Cu在肝臟和魚卵中積累較多，在組織器官中的累積為：魚卵>肝臟>魚鰓>肌肉>腎臟；Zn在魚鰭、魚鰓、魚卵、肝臟中積累較多，而在腎臟中積累較少，累積大小順序為：魚卵>魚鰭>魚鰓>肝臟>肌肉>腎臟。賀亮等[17]采用火焰原子吸收分光光度法研究了重金屬Cu在鯽魚體內(nèi)不同組織的積累情況，發(fā)現(xiàn)Cu在鯽魚各組織中的累積能力為：內(nèi)臟>魚鰓>肌肉。該研究得出的肝組織是主要的累積組織的結論與前人的研究結果相似[16-18]。

表1渾河沈陽城市段水體中各金屬元素含量

注：*表示處理組與對照組相比差異顯著。a表示世界衛(wèi)生組織飲用水水質(zhì)標準(2004)；b表示中國飲用水衛(wèi)生標準(2005)；c表示中國地表水環(huán)境質(zhì)量標準CSWQS，GB3838—2002

Note：Asterisks indicated statistical significance of comparison between the treatment group and the control (P<0.05).a.Guidelines for Drinking-Water Quality,World Health Organization (2004);b.Sanitary Standard for Drinking Water,China (2005);c.Quality Standard for Surface Water,China.CSWQS,GB3838-2002

2.3水中重金屬對斑馬魚各組織中抗氧化酶、MDA、AChE、T-AOC和Na+K+-ATPase含量的影響酶類是生物體內(nèi)所有生化反應的中間體，任何的生化反應都可以通過酶活性來了解生化反應的變化。該研究通過測定斑馬魚各組織的酶活性來了解重金屬對魚體機能的影響程度。由圖1可知，斑馬魚鰓、肝、腸組織中，SOD和CAT活性均出現(xiàn)顯著誘導，肝組織中SOD和CAT增加率分別為109.1%和32.0%。SOD是金屬酶，屬于銅酶，研究表明低濃度的銅可以誘導CAT活性的增加，一方面可能是由于累積在魚體內(nèi)的重金屬激發(fā)大量的過氧化物，另一方面可能是受SOD的應激反應發(fā)生[14]。渾河水中Cu含量高于對照組42.9%，其脅迫作用使生物體產(chǎn)生大量含氧自由基，斑馬魚機體產(chǎn)生SOD清除含氧自由基，是抵抗外界刺激的一種防御機制[19-20]。這與宋志慧等[20]的研究結果一致：0.01 mg/L Cu2+暴露斑馬魚1 d，SOD、CAT活性增加，顯著高于對照組，且Cu2+對CAT時間影響因子比較大。而戴家銀等[24]研究表明，真鯛幼魚暴露于不同濃度的Cu和Zn 4 d后，對鰓和肝臟的CAT都有抑制作用，與該研究結果相反，這可能是由于受不同暴露濃度和暴露時間影響所致。

表2 水體重金屬對斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織各金屬元素含量的影響

注：*P<0.05

Note：*P<0.05

注：*P<0.05 Note:*P<0.05圖1 水體重金屬作用對斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織SOD、GSH、GST、CAT、MDA、AChE、T-AOC和Na+K+-ATPase的影響Fig.1 Levels of SOD,GSH,GST,CAT,MDA,AChE,T-AOC and Na+K+-ATPase in brain,gills,liver,intestine and muscle of zebrafish after heavy metals stress in water

T-AOC是近年研究發(fā)現(xiàn)的用于衡量機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，它的大小可代表和反映機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態(tài)[19-24]。該研究中，處理組斑馬魚各組織中T-AOC顯著下降，說明各組織抗氧化能力下降。馬莉芳[23]研究表明，黃河鯉長時間暴露于高銅溶液中，可降低T-AOC的活力。

鰓組織中MDA顯著升高了59.2%，表明水體重金屬引起脂質(zhì)過氧化，誘導了斑馬魚鰓組織的氧化損傷。

斑馬魚腦和肌肉組織中的Na+K+-ATPase活性顯著下降，說明在處理組水體環(huán)境中，斑馬魚能量得不到充足的供應，代謝活動受到干擾，抵抗力降低，加速組織的衰老及死亡。魯雙慶等[9]研究表明，魚的肝臟是主要的解毒器官，當魚處于Cu2+污染環(huán)境中，Cu2+會隨著血液循環(huán)進入肝臟，與肝組織中某些重要酶的活性基團結合，對肝臟的生理活動產(chǎn)生影響。另外，該研究中，斑馬魚鰓組織GSH顯著升高，肌肉組織GST顯著下降，腦、腸和肌肉組織的AChE活性顯著降低。GST在解毒環(huán)境污染物這種外源性親電物質(zhì)中揮發(fā)著主要的作用[25]。氧化脅迫增加GST，這是一種細胞抗氧化脅迫的防御機制[26]，但是當這種脅迫超過細胞的防御能力時，GST降低。麥穗魚鰓組織中GSH濃度的改變表明，渾河水中重金屬的作用影響了麥穗魚的抗氧化功能，類似的研究結果也有報道[27]。AChE是存在于中樞或外圍神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)[28]，AChE活性的抑制已經(jīng)被作為神經(jīng)毒性的標志物[29]。魚暴露于毒性物質(zhì)后，通常會觀察到AChE活性顯著降低，通過抑制AChE的活性，累積乙酰膽堿，影響魚的游動和生殖行為[30]。

研究中渾河水脅迫斑馬魚的酶活性發(fā)生顯著變化，是受多種金屬離子聯(lián)合作用的結果。而金屬離子的聯(lián)合作用比較復雜，其聯(lián)合毒性作用效應不僅與污染物的組成有關，也與測試生物有關。此外，不同的作用時間及毒性配比也會產(chǎn)生不同的結果。實際的水環(huán)境更為復雜，即使相同毒物不同時間下毒性作用也會發(fā)生變化[31]。因此，單一及聯(lián)合重金屬對水生生物的作用有待進一步研究。

3 結論

渾河水中Cu、Fe、Mn、Zn含量符合我國地表水環(huán)境質(zhì)量 Ⅱ 類水質(zhì)標準，與對照組相比分別高出42.9%、217.2%、77.8%和96.2%。

渾河水脅迫下的斑馬魚各組織中，重金屬呈現(xiàn)不同程度的累積，肝組織累積量最高。

渾河水脅迫下的斑馬魚肝組織中SOD和CAT增加率分別為109.1%和32.0%，T-AOC顯著下降28.5%，說明肝組織抗氧化能力下降。斑馬魚鰓組織中MDA顯著升高59.2%，表明斑馬魚鰓組織明顯的氧化損傷。

斑馬魚肝鰓組織較為敏感，SOD、CAT、T-AOC及MDA可作為敏感的毒理學研究的生物標志物，通過檢測能夠反映重金屬共同作用對斑馬魚的生態(tài)健康影響，對水體綜合毒性進行早期預警，同時也可作為有效的水環(huán)境污染監(jiān)測參考指標。

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