田 瑞，夏 燕，馮 佳，楊年安，向 陽(yáng)，陳安平，袁 林

(湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施 445000)

三百棒(ToddaliaasiaticdLam.)又名見(jiàn)血飛、大救駕等，為蕓香科飛龍掌血屬植物的根和根皮，主產(chǎn)于湖南、湖北、貴州、四川等地，非洲東部及亞洲東南部和南部均有分布。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，三百棒具有活血散瘀、舒筋通絡(luò)、消腫止痛的作用，常用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、胃痛及痛經(jīng)[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，三百棒具有治療胃腸炎、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛及抑菌等作用[2-5]。

關(guān)于三百棒多糖的研究較少[6-7]。筆者采用響應(yīng)面分析方法對(duì)三百棒多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為三百棒多糖的提取工藝研究提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)三百棒多糖的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料三百棒采于湖北省恩施州咸豐縣，經(jīng)湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院制劑室張國(guó)安主任藥師鑒定為飛龍掌血(ToddaliaasiaticaLam.)。蒽酮、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸均為分析純。

1.2儀器BILON-W420 數(shù)顯三用恒溫水箱，西安德派生物技術(shù)有限公司； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；離心機(jī)，eppendorf公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；冷凍干燥機(jī)(GOID-S2M),上海歐蒙實(shí)業(yè)有限公司。

1.3三百棒多糖的提取稱(chēng)取一定質(zhì)量的三百棒干粉，加入適量的水，攪拌均勻，在一定溫度下浸提一定時(shí)間，然后離心(3 000 r/min，10 min)，濃縮，醇沉4 ℃過(guò)夜，離心(3 000 r/min,10 min)，Sevage法脫蛋白[8]，然后濃縮揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，真空冷凍干燥。

1.4單因素試驗(yàn)設(shè)定料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g∶mL)]、提取溫度(40、60、80、100 ℃)、提取時(shí)間(2.0、3.0、4.0、5.0 h)、提取次數(shù)(2、3、4、5次)為自變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.5三百棒多糖含量的測(cè)定

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。采用蒽酮硫酸法[9]測(cè)定三百棒多糖含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，定容于200 mL容量瓶，即得0.5 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，以2.0 mL蒸餾水為空白，然后各自加入0.5及5.0 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴1.0 min，630 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為Y=0.008 0X+0.000 8,R2=0.999 2。

1.5.2樣品多糖含量的測(cè)定。脫蛋白后，取5.0 mL定容于10.0 mL，量取0.5 mL，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，按照“1.5.1”的步驟測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算三百棒多糖含量。

1.6三百棒多糖提取的中心組合試驗(yàn)[10-11]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.05b分析料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4因素中影響較大的3水平，分別以-1、0、1表示，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果由圖1可知，隨著料液比的增加，三百棒多糖的得率快速增加，當(dāng)料液比達(dá)1∶15后，三百棒多糖的得率增加緩慢，可見(jiàn)增大料液比有利于三百棒多糖的提取，但增大到一定程度后，三百棒多糖的得率基本趨于穩(wěn)定。

表1 Box-Bennhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

圖1 料液比對(duì)三百棒多糖提取率的影響Fig.1 Effects of solid liquid ratio on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.polysaccharides

由圖2可知，隨著溫度增加，多糖的得率快速增加，溫度達(dá)80 ℃后稍有下降，可能是由于高溫條件下一部分多糖發(fā)生水解[12]，導(dǎo)致多糖損失，另外溫度過(guò)高會(huì)使許多雜質(zhì)含量增加，造成三百棒多糖的分離困難。由此可知，三百棒多糖的提取溫度以80 ℃最好。

圖2 提取溫度對(duì)三百棒多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.polysaccharides

由圖3可知，在一定提取時(shí)間內(nèi)，三百棒多糖的得率隨著時(shí)間的增加而增加，在4.0 h時(shí)達(dá)到最高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)5.0 h時(shí)，多糖得率稍有下降，可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致三百棒多糖部分降解[13]，由此可知，三百棒多糖的提取時(shí)間以4 h最好。

由圖4可知，三百棒多糖的得率隨著提取次數(shù)的增加逐漸增加，但當(dāng)提取次數(shù)達(dá)3次后，多糖的得率趨于穩(wěn)定，并稍有下降，可見(jiàn)三百棒多糖的提取次數(shù)宜選擇3次。

圖3 提取時(shí)間對(duì)三百棒多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction times on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.’s polysaccharides(TALP)

圖4 提取次數(shù)對(duì)三百棒多糖提取率的影響Fig.4 Effects of extraction times on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.’s polysaccharides

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)法，選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)因素中影響較大的4因素，進(jìn)行4因素3水平的中心組合試驗(yàn)，以三百棒多糖得率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化三百棒多糖的提取工藝條件(表2)。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，以料液比(X1)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取次數(shù)(X4)為自變量，三百棒多糖提取率(Y)為響應(yīng)值。其回歸方程：

Y=4.540+0.140X1+0.440X2+0.170X3+0.400X4+0.190X1X2+0.070X1X3+0.062X1X4+0.033X2X3+0.057X2X4-0.015X3X4-0.200X12-0.530X22-0.150X32-0.290X42

利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，并對(duì)回歸方程的系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2.3最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)回歸模型的分析結(jié)果，得到三百棒多糖提取的最佳工藝條件：料液比1∶14.87，提取溫度93.16 ℃，提取時(shí)間3.85 h，提取次數(shù)3.83次，在該條件下三百棒多糖提取率的預(yù)測(cè)值為4.99%。考慮到實(shí)際操作情況，將最佳提取工藝修正為料液比1∶15，提取溫度93 ℃，提取時(shí)間4 h，提取次數(shù)3次，在此條件下，三百棒多糖提取率為4.75%。預(yù)測(cè)值和實(shí)際值很接近，偏差較小，因此此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠(圖5)。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，并由回歸模型的方差分析結(jié)果可知4個(gè)因素的影響均顯著。三百棒多糖的最佳提取工藝條件：料液比1∶15，提取溫度93 ℃，提取時(shí)間4 h，提取次數(shù)3次。在此條件下得到的多糖提取率為4.75%，接近預(yù)測(cè)值4.99%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化三百棒多糖的提取工藝準(zhǔn)確可靠，科學(xué)可行，具有很好的參考價(jià)值。

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