李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠(yuǎn)

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是一類超家族蛋白，該蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。該蛋白最早是在1958年被發(fā)現(xiàn)[1]，但其蛋白本質(zhì)到了1962年才得到初步解析。研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白是一類含有血紅素的金屬硫醇鹽蛋白，它能與CO結(jié)合且在450 nm處有很強(qiáng)的吸收峰，因此將該蛋白命名為P450[2]。昆蟲P450包含多個(gè)家族成員，每個(gè)家族又包含多個(gè)亞族，每個(gè)亞族又具有多個(gè)同功異構(gòu)酶。其命名方式大致為，把序列同源性大于40%的歸為同一個(gè)家族，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如CYP6。再將同一家族里序列同源性大于55%的歸為同一亞族，用字母表示，如CYP6A。最后，再把同一亞族同源性大于55%的歸為同工酶，再用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如CYP6A1[3]。通過NCBI檢索發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道到的昆蟲CYP大多數(shù)集中在8目60多種昆蟲中，內(nèi)容涉及CYP3，CYP4，CYP6，CYP9，CYP12等多個(gè)家族。

前人研究結(jié)果表明，CYP6是整個(gè)CYP超家族中最為重要的一族，該家族所包含的基因數(shù)量遠(yuǎn)超過其他家族，占據(jù)所有CYP的60%以上。有少數(shù)報(bào)道了CYP2，CYP4和CYP9在昆蟲解毒農(nóng)藥的過程中發(fā)揮重要的作用，例如CYP3的CYP337B3能夠催化氰戊菊酯的羥基化作用，而導(dǎo)致該蟲對(duì)該藥產(chǎn)生抗藥性[4]。但大多數(shù)研究表明，與昆蟲抗藥性最為相關(guān)的是CYP6家族。例如，Puinean等研究了對(duì)新煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的桃蚜，發(fā)現(xiàn)CYP6CY3在抗性品系中的表達(dá)倍數(shù)是敏感品系的9倍。以及研究較為成熟的昆蟲果蠅，發(fā)現(xiàn)抗擬除蟲菊酯類殺蟲劑的LPR品系果蠅中CYP6D1的表達(dá)量是敏感品系的10倍[5]。對(duì)小菜蛾的研究發(fā)現(xiàn)，抗氯氰菊酯的果蠅CYP6BG1和CYP6BG2的表達(dá)量是其相對(duì)敏感品系的4.9和3.8倍[4]。

茶小綠葉蟬是我國(guó)茶樹上的重要害蟲，每年對(duì)茶樹的為害損失達(dá)到了10%～20%[6]。對(duì)該蟲的有效防治對(duì)提高茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的作用。然而，該蟲的防治效果一直不理想，其最主要的原因是該蟲對(duì)常規(guī)農(nóng)藥產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，且每年呈現(xiàn)不斷加強(qiáng)的趨勢(shì)。因而開發(fā)基于以CYP為靶標(biāo)的新型分子抑制劑，對(duì)茶小綠葉蟬的防治具有重要的理論和實(shí)踐意義?；诖?，本文在前期獲得的茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出了CYP超家族的6A14基因(CYP6A14)(Unigen0016372)，通過RT-PCR對(duì)其堿基序列進(jìn)行克隆校正。在此基礎(chǔ)上，通過生物學(xué)在線網(wǎng)站和軟件對(duì)其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、進(jìn)化樹、氨基酸比對(duì)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能域進(jìn)行了分析和模擬。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)昆蟲茶小綠葉蟬，采集自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所2號(hào)山茶園(福安市，社口鎮(zhèn)，東經(jīng)119°32′～119°38′，北緯27°8′～27°13′)。采用水培養(yǎng)梢的方法室內(nèi)飼養(yǎng)茶小綠葉蟬，通過改進(jìn)的粉塵采樣器對(duì)2～3齡若蟲進(jìn)行采集，樣品保存于1.5 mL離心管中，并加入RNA later保存液，放置于-80℃冰箱中保持備用。茶小綠葉蟬飼養(yǎng)及采集方法參見李良德[6]。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit)、總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)、DNA回收試劑盒、dNTP(2.5 mmol·L-1)、DNA Taq聚合酶(高保真)、連接載體(pMD19-T)、DNA Marker(DL 2000)等。

1.3 總RNA提取及cDNA模板的構(gòu)建

取出保存于-80℃冰箱的茶小綠葉蟬樣品，吸除RNA later，將2～3齡小綠葉蟬(約100頭)加入液氮研磨，取出研磨粉，按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。電泳檢測(cè)核糖體5S，18S，28S條帶的完整性，對(duì)所提取的總RNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。再按照總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明說，將其反轉(zhuǎn)成cDNA模板，用于后續(xù)克隆使用。

1.4 茶小綠葉蟬目的基因的克隆

根據(jù)前期獲得的茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組，從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出了CYP6A14基因(Unigen0016372)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該目的基因含有完整ORF編碼區(qū)。進(jìn)而在5′端和3′端設(shè)計(jì)兩對(duì)交叉引物CAGCTGTCTCTTGCCAGGAT/CAGTAAGTGTGAAATCTGGA與GAACAAGCTGCAGACTTGAG/GCGTTGGTATTAGTGCAAT對(duì)該基因的堿基進(jìn)行克隆校對(duì)。RT-PCR擴(kuò)增程反應(yīng)序按照：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 1.5 min，72℃ 50 s，33個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min；4℃，保存?zhèn)溆?。最后，將所克隆的目的片段與pMD19-T進(jìn)行連接，后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取12個(gè)白斑，進(jìn)行測(cè)序。

1.5 茶小綠葉蟬CYP 6A14基因的生物信息學(xué)分析

茶小綠葉蟬CYP6A14基因序列拼接由DNAstar的Editseq軟件完成；進(jìn)入ExPASy-ProtParam tool在線網(wǎng)站，對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；使用MEGA 4.0軟件，采用1000次重復(fù)比對(duì)的臨位分析法(neighbor-joining，NJ)，制作該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹；進(jìn)入Multalin interface page在線網(wǎng)站，設(shè)置每行130個(gè)氨基酸，對(duì)CYP6A14的編碼氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)；進(jìn)入SWISS-MODEL | Home Page在線網(wǎng)站，選擇Normal mode分析該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；最后，進(jìn)入SMART：Main page在線網(wǎng)站中，對(duì)該蛋白的功能域進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶小綠葉蟬CYP 6A14基因的克隆

通過PCR克隆獲得了茶小綠葉蟬CYP6A14基因的全編碼區(qū)序列。該克隆所獲得的基因片長(zhǎng)1696 bp，包含21 bp的5′端序列，1467 bp的ORF編碼區(qū)序列(編碼488個(gè)氨基酸)(圖1)和208 bp的3′端序列。通過ExPASy ProtParam tool在線網(wǎng)站對(duì)ORF的488個(gè)氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白的分子式為C2572H3936N654O701S24，分子量為56.00 kDa，理論的等電點(diǎn)和疏水性分別為7.60和-0.111。另外，氨基酸組成排名前5的為異亮氨酸Leu(L)，苯丙氨酸Phe(F)，纈氨酸Val(V)，賴氨酸Lys(K)和脯氨酸Pro(P)，分別占比10.2%，7.2%，7.2%，6.6%和6.4%。

圖1 茶小綠葉蟬P450 CYP6A14基因的ORF序列Fig.1 ORF sequence of P450 CYP6A14 gene from E. flavescens

2.2 茶小綠葉蟬CYP6A14的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將茶小綠葉蟬CYP6A14導(dǎo)入NCBI進(jìn)行比對(duì)，在庫(kù)中進(jìn)行分析并下載得到中華蜜蜂Apiscerana(XM_017066603.1)、鉆木甲蟲Agrilusplanipennis(XM_018463767.1)、細(xì)針果蠅Drosophilaeugracilis(XM_017210654.1)、褐飛虱Nilaparvatalugens(KM217019.1)、菜青蟲Pierisrapae(KY212073.1)、多胚跳小蜂Copidosomafloridanum(XM_014363382.1)、小黃家蟻Monomoriumpharaonis(XM_012670919.1)、赤擬谷盜Triboliumcastaneum(XM_965606.3)、榕小蜂Ceratosolensolmsi(XM_011503845.1)、溫室希蛛Parasteatodatepidariorum(XM_021146529.1)、小蜂窩甲蟲Aethinatumida(XM_020023829.1)、二斑葉螨Tetranychusurticae(XM_015931596.1)、溫帶臭蟲Cimexlectularius(XM_014405847.1)的基因序列。將這些序列與茶小綠葉蟬CYP6A14進(jìn)行合并，導(dǎo)入MEGA 4.0，制作獲得茶小綠葉蟬CYP6A14的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。由圖2可以看出，茶小綠葉蟬與赤擬谷盜Triboliumcastaneum(XM_965606.3)的親緣關(guān)系最近，其次為二斑葉螨Tetranychusurticae(XM_015931596.1)，而與溫室希蛛Parasteatodatepidariorum(XM_021146529.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 茶小綠葉蟬CYP6A14基因的氨基酸序列比對(duì)

將茶小綠葉蟬CYP6A14基因編碼的氨基酸導(dǎo)入NCBI，選擇Protein Blast進(jìn)行氨基酸比對(duì)，分析并下載得到細(xì)針果蠅Drosophilaeugracilis(XP_017066143.1)、小黃家蟻Monomoriumpharaonis(XP_012526373.1)、褐飛虱Nilaparvatalugens(AIW79982.1)、多胚跳小蜂Copidosomafloridanum(XP_014218868.1)、菜青蟲Pierisrapae(ARA91637.1)的氨基酸序列。將這些氨基酸與茶小綠葉蟬CYP6A14編碼的氨基酸進(jìn)行合并制成faste文檔，導(dǎo)入Multalin在線網(wǎng)站進(jìn)行保守性分析。結(jié)果顯示，茶小綠葉蟬CYP6A14編碼的氨基酸保守性較差，且與其他物種存在多處匹配斷點(diǎn)，特別是在160～180，270～320和360～370位點(diǎn)的氨基酸斷點(diǎn)明顯(圖3)。

圖2 茶小綠葉蟬CYP6A14基因的進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of CYP6A14 gene from E. flavescens注：樹中數(shù)字越大代表親緣關(guān)系越近

圖3 茶小綠葉蟬CYP6A14基因編碼的氨基酸與其他物種的多重比對(duì)Fig.3 Amino acid alignments of CYP6A14 genes from E. flavescens and other insects注：紅色代表氨基酸全部一樣，藍(lán)色代表有一個(gè)氨基酸不一樣，黑色代表有2個(gè)以上氨基酸不一樣

2.4 茶小綠葉蟬CYP6A14的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬及功能域分析

通過Swiss Model對(duì)茶小綠葉蟬CYP6A14基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，結(jié)果表明該基因能與庫(kù)中已有的細(xì)胞色素 P450三級(jí)模型相互匹配，該模型只有一種結(jié)構(gòu)，包含少數(shù)β折疊，大部分由α螺旋構(gòu)成(圖4)。

進(jìn)而在Smart在線網(wǎng)站分析了該蛋白的功能域，結(jié)果表明，該蛋白在34～483位點(diǎn)含有一個(gè)p450蛋白域(Pfam: p450)，而無信號(hào)肽(signal peptides)和跨膜結(jié)構(gòu)(transmembrane structure)(圖5)，暗示該蛋白結(jié)構(gòu)功能單一。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞色素P450基因與昆蟲的抗藥性密切相關(guān)，該基因由多個(gè)家族組成，本研究從前期已獲得的茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出了第六家族基因CYP6A14，并通過RT-PCR對(duì)該基因的堿基序列進(jìn)行了校對(duì)。結(jié)果顯示，該基因片長(zhǎng)為1696 bp，含有1467 bp ORF編碼區(qū)，能編碼488個(gè)氨基酸。將該基因與NCBI庫(kù)中的其他序列進(jìn)行比對(duì)，獲得的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，CYP6A14與赤擬谷盜親緣關(guān)系最近，與溫室希蛛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。并進(jìn)一步比對(duì)了氨基酸的保守性，結(jié)果表明CYP6A14編碼的氨基酸保守性較差。最后，進(jìn)一步明確該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能域特征，發(fā)現(xiàn)該蛋白以α螺旋為主，擁有一P450蛋白域(Pfam: p450)，而無信號(hào)肽(signal peptides)和跨膜結(jié)構(gòu)(transmembrane structure)。

圖4 茶小綠葉蟬CYP6A14基因編碼蛋白的三級(jí)模型Fig.4 Tertiary structure of CYP6A14 protein from E. flavescens

現(xiàn)已明確，CYP6與多種昆蟲的抗藥性密切相關(guān)，如岡比亞按蚊Anophelesgambiae的CYP6Z1上調(diào)表達(dá)是其對(duì)DDT產(chǎn)生抗藥性的主要原因[7]。以及灰飛虱Laodelphaxstriatellus的CYP6CW1上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致了該蟲對(duì)噻嗪酮?dú)⑾x劑產(chǎn)生抗藥性[8]。導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗壓性的原因除基因上調(diào)表達(dá)外，另一方面則是基因的堿基發(fā)生突變導(dǎo)致的結(jié)果。如棉鈴蟲的CYP687基因的編碼區(qū)發(fā)生了14個(gè)堿基突變，導(dǎo)致該蟲對(duì)氰戊菊酯產(chǎn)生抗藥性[9]，以及淡色庫(kù)蚊Culexpipiens的CYP4基因發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)突變，導(dǎo)致該蟲對(duì)溴氰菊酯產(chǎn)生抗藥性[10]。另外，發(fā)生突變的基因具有遺傳的作用，如抗溴氰菊酯的斜紋夜蛾Spodopteralitura，抗性基因在常染色體上不完全顯性，但能夠長(zhǎng)期遺傳[11]。這就說明了為什么屬于半翅目的茶小綠葉蟬能與屬于鞘翅目的赤擬谷盜親緣關(guān)系較近，以及為什么茶小綠葉蟬CYP6A14基因編碼的氨基酸序列保守性較差，可能是由于抗性基因發(fā)生突變并遺傳給了后代，導(dǎo)致突變堿基長(zhǎng)期累加造成的結(jié)果。

圖5 茶小綠葉蟬CYP6A14基因的蛋白功能域Fig.5 Functional domain of CYP6A14 gene from E. flavescens

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