雷奇林，蘇 青,2△，凌保東,2，曹祥菊，潘映橋，楊 逍，劉 潔

1. 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院(成都 610500)；2. 四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點實驗室(成都 610500)

中藥治療疾病是多成分的整體作用[1]，將黃芩提取物整體入藥可以實現(xiàn)其藥用價值的最大化。黃芩具有清熱燥濕、止血安胎、瀉火解毒、抗癌、抗菌、抗病毒等功效[2-7]。黃芩提取物中的黃酮類化合物是其主要的藥效組分[8]，包括：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素[9]。其中，黃芩素與漢黃芩素是游離苷元，加之分子平面結(jié)構(gòu)的平面性較強(qiáng)，分子排列緊密，分子間引力較大，難溶于水；黃芩苷、漢黃芩苷屬于酚苷，但由于糖基的影響，也使得其幾乎不溶于水[10]。由于黃芩提取物中的主要成分是黃芩苷，其在胃中屬于中等程度吸收[11]，限制其生物利用度的主要因素是溶解度。因此，提高黃芩提取物中主要成分的溶解度是提高其生物利用度的有效辦法。

β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)是一類由D-吡喃型葡萄糖通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的一種低聚糖，其分子呈上寬下窄中空的環(huán)筒狀，可以與多種客體以偶極力、范德華力、疏水作用、空間匹配效應(yīng)及氫鍵等相互作用形成主客體包合物[12]，是一種良好的天然包合材料。在現(xiàn)代藥劑學(xué)中，β-CD及其衍生物因能增加藥物溶解度，提高藥物生物利用度而得到廣泛應(yīng)用[13]，如宋全道等[14]用部分甲基化-β-CD與槲皮素形成包合物，增加了桷皮素的溶解度，提高了藥效；于生蘭等[15]制備黃芩苷β-CD包合物，從而提高了水溶性和穩(wěn)定性，降低了藥物苦味；程建明等[16]將黃芩苷和羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrins，HP-β-CD)包合物制備成注射劑，改善了劑型，提高了藥物的生物利用度。

本研究希望利用分子對接的方法來比較不同環(huán)糊精對黃芩提取物整體包合效果的不同，以期找到包合效果最好的環(huán)糊精，為黃芩的制劑研究提供參考。本研究構(gòu)建了環(huán)糊精其衍生物與黃芩提取物中主要成分的分子模型，通過將環(huán)糊精及其衍生物與黃芩提取物主要成分兩兩對接，得到了它們之間的平均作用能，并參考黃芩提取物中各成分的含量，計算出不同環(huán)糊精對黃芩提取物的總體包合效果，以篩選出整體包合效果好的環(huán)糊精(或其衍生物)。并以β-CD為例，通過構(gòu)象分析篩選合理的構(gòu)象，初步探索它們相互作用模式以及使得包合物穩(wěn)定的因素。

1 儀器與方法

1.1 實驗軟件

化學(xué)結(jié)構(gòu)繪制軟件ChemOffice 2008；分子對接軟件AutoDock(Version 4.02.Autodock)；分子顯示軟件PyMOL1.5.0；量子化學(xué)計算軟件Gaussian 03；分子格式轉(zhuǎn)化軟件Open Babel GUI 。

1.2 分子模型構(gòu)建

1.2.1 環(huán)糊精及其衍生物分子模型建立 1)β-CD模型：從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫PDB(www.rcsb.org)中得到β-CD與酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)文件(3CGT)[17]，在清除蛋白質(zhì)與H2O的坐標(biāo)文件后，保存為GJF文件，采用半經(jīng)驗算法中的PM3基組進(jìn)行頻率計算與幾何構(gòu)型優(yōu)化，未發(fā)現(xiàn)虛頻，證明優(yōu)化后的分子構(gòu)象處于最小的能量狀態(tài)，并用Open Babel軟件將輸出文件轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精分子的pdb文件格式，用于后面對接過程。2)單取代2-HP-β-CD模型：將用PM3優(yōu)化得到的β-CD模型用ChemOffice軟件打開，將7個葡萄糖單元中的1個2位羥基固定，按照SN2取代物機(jī)制，用2-羥基丙基(使用正常鍵長與鍵角)替換2位羥基，在優(yōu)化鍵長與鍵角之后，按照上述步驟得到HP-β-CD模型，并保存為pdb文件格式，用于后續(xù)運(yùn)算。3)雙取代羧甲基-β-環(huán)糊精(carboxymethyl-β-cyclodextrin，CM-β-CD)、雙取代磺丁基醚-β-環(huán)糊精(sulfobutylether-β-cyclodextrin，SBE-β-CD)和雙取代甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin，Me-β-CD)分子模型：將用PM3優(yōu)化得到的β-CD模型用ChemOffice軟件打開，將7個葡萄糖單元中的1個2位羥基和其對位的葡萄糖單元中的6位羥基固定，按照SN2親和取代機(jī)制，分別用羧甲基、磺丁基與甲基(使用正常鍵長與鍵角)替換2位和6位上羥基上的氫，在優(yōu)化鍵長與鍵角之后，按照上述步驟分別得到CM-β-CD、SBE-β-CD和Me-β-CD模型，并保存為pdb文件格式用于后續(xù)運(yùn)算。

1.2.2 黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素分子模型建立 用ChemOffice軟件建立4種分子的分子模型(表1)，用Chem3d中的MM2方法對建立起的分子模型進(jìn)行優(yōu)化，得到分子的最小能量構(gòu)象，并保存為pdb格式，用于后續(xù)的對接步驟。

1.3 分子對接

用AutoDockTools軟件準(zhǔn)備受體(環(huán)糊精及衍生物)與配體(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素)的坐標(biāo)文件，添加H原子與原子電荷，并設(shè)置配體分子內(nèi)可旋轉(zhuǎn)單鍵數(shù)量及根原子(表1)。分別保存為pdbqt格式文件(擴(kuò)展pdb格式，用于存儲坐標(biāo)、電荷及原子類型等信息)。在分子對接過程中，均以受體幾何中心為對接盒子的中心點，盒子尺寸、對接參數(shù)均使用默認(rèn)值，搜索參數(shù)選用遺傳算法，對接方法采用剛性對接，對接100次。

表1配體分子及配體分子的可旋轉(zhuǎn)鍵配體分子的可旋轉(zhuǎn)鍵

2 結(jié)果

2.1 β-CD與黃芩提取物的分子對接結(jié)果分析

1)

表2 β-CD與黃芩苷分子對接結(jié)果的成簇分析及結(jié)合能

β-CD與黃芩苷分子的平均結(jié)合能為-4.394 5 kCal/mol。

圖1 β-CD與黃芩苷分子對接結(jié)果的成簇分析圖

查看所有的對接構(gòu)象，沒有出現(xiàn)黃芩苷分子脫離環(huán)糊精空腔的情況，說明黃芩苷分子能和環(huán)糊精形成穩(wěn)定包合物，其構(gòu)象及相互作用如下所示，黃芩苷分子中的羧基、羥基與環(huán)糊精7個葡萄糖單元中的某兩個-OH形成氫鍵，這樣的構(gòu)象有兩個優(yōu)勢：1)氫鍵結(jié)合降低能量；2)黃芩苷分子在環(huán)糊精內(nèi)呈傾斜狀，使得苯環(huán)能收縮在疏水空腔內(nèi)，使得包合物體積緊湊，能量降低。在對接結(jié)果中，β-CD與黃芩苷的最低能量構(gòu)象如下所示，黃芩苷分子幾乎全部包合在環(huán)糊精空腔內(nèi)部，幾何中心與環(huán)糊精空腔中心非常接近，苯環(huán)位于環(huán)糊精空腔的窄開口端，黃芩苷分子中的羧基位于環(huán)糊精空腔的寬開口端。從電性因素來看，黃芩苷分子中的羧基極性比苯環(huán)強(qiáng)，苯環(huán)與之相比有進(jìn)入空腔內(nèi)優(yōu)勢，因而暴露于空腔外(圖2A)。

用同樣的方法分析β-CD與黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素的對接結(jié)果，其構(gòu)象與相互作用分別如下所示。均未發(fā)現(xiàn)配體分子脫離β-CD空腔的解，說明β-CD能與黃芩提取物中的4種主要成分形成穩(wěn)定包合物。β-CD與黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素的最低結(jié)合能分別為-5.84 kCal/mol、-5.02 kCal/mol、-5.70 kCal/mol，分別占對接結(jié)果的48%、23%、21%。對接中最低構(gòu)象能量越低，所占比例越大，說明對接收斂性越好，形成的包合物也越穩(wěn)定。在形成包合物的過程中，該過程是自發(fā)進(jìn)行的[18]。按式1計算出其平均結(jié)合能分別為：-5.813 2 kCal/mol、-4.366 5 kCal/mol、-5.228 8 kCal/mol。β-CD對黃芩提取物中4種主要成分的包合能力為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷(圖2B～D)。

2.2 環(huán)糊精衍生物與黃芩提取物4種主要成分對接結(jié)果分析

依照相同方法，分析剩下4種環(huán)糊精的衍生物(HP-β-CD、CM-β-CD、SBE-β-CD、Me-β-CD)與黃芩提取物中的4種主要成分的對接結(jié)果，均未發(fā)現(xiàn)脫離空腔的解，說明環(huán)糊精衍生物與黃芩提取物之間能形成穩(wěn)定包合物。按式1計算出它們之間的平均作用能(表3)。通過比較平均結(jié)合能的大小可知，HP-β-CD對4種配體的包合效果為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷；CM-β-CD對4種配體的包合能力為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷；SBE-β-CD對4種配體的包合能力為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷；Me-β-CD對4種配體的包合能力為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷。通過以上分析可知：5種環(huán)糊精對4種主要成分(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素)的包合順序是一致的，均為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷。這是因為相較于黃芩苷與漢黃芩苷而言，黃芩素與漢黃芩素為苷元，其分子更小(表1)，進(jìn)入環(huán)糊精及其衍生物空腔后，能更完全的被空腔所包裹，使得體系的能量更低，包合物更加穩(wěn)定。而黃芩苷與漢黃芩苷分子更大，在形成包合物后，它們的苯環(huán)伸出了環(huán)糊精空腔外(圖2)，這就降低了黃芩苷和漢黃芩苷與環(huán)糊精之間的結(jié)合能，使得體系能量升高，包合物穩(wěn)定性降低。另外，由于作為苷元的黃芩素分子相較于漢黃芩素而言，黃芩素分子中多了兩個羥基，更易與環(huán)糊精上的羥基形成氫鍵，從而增加了黃芩素與環(huán)糊精形成包合物的穩(wěn)定性。黃芩苷與漢黃芩苷之間的差異也是同樣原因。因而就苷元與苷來說，苷元的結(jié)合能力比苷強(qiáng)。就兩種苷與兩種苷元來說，黃芩苷的結(jié)合能力高于漢黃芩苷，黃芩素高于漢黃芩素。

圖2 β-CD與黃芩苷提取物的最低能量構(gòu)象及相互作用圖

注：A. β-CD與黃芩苷對接的最低能量構(gòu)象及相互作用圖；B.β-CD與黃芩素對接的最低能量構(gòu)象及相互作用圖；C.β-CD與漢黃芩苷對接的最低能量構(gòu)象及相互作用圖；D.β-CD與漢黃芩素對接的最低能量構(gòu)象及相互作用圖

表3環(huán)糊精及其衍生物與黃芩提取物主要成分分子對接平均結(jié)合能(kCal/mol)

β-CD及其衍生物黃芩苷黃芩素漢黃芩苷漢黃芩素β-CD-4.3945-5.8132-4.3665-5.2288HP-β-CD-4.9728-6.4300-4.4401-5.7304CM-β-CD-4.6470-6.0363-4.4544-5.6442SBE-β-CD-5.5456-6.8591-5.2191-6.1926Me-β-CD-4.6595-5.9036-4.6577-5.5947

2.3 環(huán)糊精及其衍生物對黃芩提取物總體包合效果

黃芩提取物有兩種，一種是利用各種方法對黃芩進(jìn)行一次提取的粗提取物(粗提品)；另一種是按中國藥典所載的多次提取的精提取物(精提品)。由于粗提品與精提品各成分含量不同，有必要就黃芩提取物粗提品與精提品分別討論。按式2計算出環(huán)糊精及其衍生物對黃芩提取物的總體包合效果，其值大小用X表示。

2)

黃芩提取物粗提品[19]和精提品[20]各主要成分的分量如下所示(表4)。

表4 黃芩提取物粗提物與精提取物中主要成分含量表(%)

分別按式2計算出β-CD及其衍生物對黃芩提取物粗提品的總體包合效果值為：Xβ-CD=0.757 4；XHP-β-CD=0.847 2；XCM-β-CD=0.796 7；XSBE-β-CD=0.939 5；XMe-β-CD=0.797 2。比較其大小：XSBE-β-CD>XHP-β-CD>XMe-β-CD> XCM-β-CD> Xβ-CD。因而，β-CD及其衍生物對黃芩提取物的總體包合效果為：

SBE-β-CD>HP-β-CD>Me-β-CD> CM-β-CD>β-CD

分別按式2計算出β-CD及其衍生物對黃芩提取物精提品的總體包合效果值為：

Xβ-CD=3.740 5；XHP-β-CD=4.226 5；XCM-β-CD=3.952 6；XSBE-β-CD=4.706 7；XMe-β-CD=3.960 0。比較其大小：XSBE-β-CD>XHP-β-CD>XMe-β-CD>XCM-β-CD>Xβ-CD。因而，β-CD及其衍生物對黃芩精提品的總體包合效果為：

SBE-β-CD>HP-β-CD>Me-β-CD>CM-β-CD>β-CD

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，無論是在粗提物還是精提物中，不同環(huán)糊精對黃芩提取物的整體包合效果都是一致的，均為：SBE-β-CD>HP-β-CD>Me-β-CD>CM-β-CD>β-CD。SBE-β-CD的包合能力最高，β-CD最低，Me-β-CD與CM-β-CD包合效果差別不大。因此，優(yōu)先考慮以SBE-β-CD為主體分子來包合黃芩提取物，其次也可選擇HP-β-CD。

3 討論

β-CD的衍生物整體包合效果都要比其自身更好，β-CD及其衍生物均能與黃芩提取物形成穩(wěn)定包合物。在對接實驗中，通過構(gòu)象分析并觀察包合物的構(gòu)象可以看出，在配體分子(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素)進(jìn)入環(huán)糊精及其衍生物的疏水性空腔以后，配體分子與受體分子之間形成了氫鍵，這一方面增加了配體分子的剛性結(jié)構(gòu)，減少了配體分子的自由度，避免了活性碰撞，從而增加了它們的水溶性[21]。另一方面，由于氫鍵的能量作用，使得形成的包合物穩(wěn)定性更好。根據(jù)對接實驗測出的平均結(jié)合能表明，β-CD及其衍生物對黃芩提取物粗提物的總體包合效果與精提物的包合效果是一致的，均為：SBE-β-CD>HP-β-CD>Me-β-CD>CM-β-CD>β-CD。

SBE-β-CD的包合效果最好，主要是因為HP-β-CD、Me-β-CD、CM-β-CD、β-CD為非電解質(zhì)。在形成的包合物體系中，SBE-β-CD在與配體形成包合物時，除了有氫鍵與疏水作用之外，還有靜電作用[21]，而HP-β-CD、Me-β-CD、CM-β-CD、β-CD則主要是依靠氫鍵與疏水作用。因此，SBE-β-CD整體的包合效果最好。另外，β-CD及其衍生物對黃芩提取物中的主要成分(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素)的包合效果順序是一致的，均為：黃芩素>漢黃芩素>黃芩苷>漢黃芩苷，這是由于苷與苷元之間的分子大小以及黃芩苷與漢黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素兩兩之間的羥基數(shù)目差異造成的。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，SBE-β-CD對黃芩提取物的整體包合效果最好，其次是HP-β-CD，由于SBE-β-CD的價格較高，從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，也可以考慮HP-β-CD。

[1]柴興云. 試論中藥涌現(xiàn)性特征[J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(13): 2480-2485.

[2]洪川. 中藥黃芩的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J]. 化工管理,2017(2):204.

[3]劉晶晶, 張貴君, 彭慧, 等. 黃芩清熱燥濕和瀉火解毒藥效組分分析[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2013, 15(11): 78-80.

[4]黃志軍. 黃芩苷藥理作用研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué), 2012, 24(3): 61-64.

[5]弓唯一. 黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導(dǎo)的肺癌進(jìn)展的影響及機(jī)制[D].上海:復(fù)旦大學(xué),2013:5.

[6]施高翔, 邵菁, 汪天明, 等. 黃芩及其有效成分抗菌作用新進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(19): 3713-3718.

[7]姜茗宸, 汪受傳, 徐秋月. 黃芩素抗病毒作用研究[J]. 吉林中醫(yī)藥, 2016, 36(7): 753-756.

[8]董文茜, 程京艷, 文春先, 等. 黃芩商品藥材中黃酮類藥效組分變化規(guī)律研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2013, 15(9): 60-63.

[9]馬宏躍, 張啟春, 周婧, 等. 黃芩中四種主要黃酮成分與環(huán)氧酶-2的分子對接研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報, 2009, 37(6): 71-74.

[10] 吳繼洲. 天然藥物化學(xué)[M]. 北京:高等教育出版社, 2010:223-339.

[11] 劉太明.黃芩苷和黃芩素的吸收機(jī)理研究[D].成都：四川大學(xué),2006:4.

[12] 郭明, 王春歌, 殷欣欣, 等. 脫氧土大黃苷-β-環(huán)糊精超分子包合物的制備及包合物性能研究[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(20): 3467-3472.

[13] 李衛(wèi)華,宋興龍. 相溶解度法研究不同環(huán)糊精對美沙拉嗪的增溶作用[J]. 中國藥師,2016,19(1):65-67.

[14] 宋全道, 丁易, 米廣太. 槲皮素-部分甲基化β-環(huán)糊精包合物的研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2003, 41(2): 206-208.

[15] 于生蘭, 孫玲, 張龍, 等. 黃芩苷-β-環(huán)糊精包合物的研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2003, 22(6): 9-12.

[16] 程建明, 劉漢清, 張興德. 黃芩苷-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備工藝研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2003, 19(6): 358-359.

[17] 胡碩. 藥物-β-環(huán)糊精包合物的制備、結(jié)構(gòu)分析及分子模擬[D]. 石家莊:河北科技大學(xué), 2011：45.

[18] 朱慶英,黃益好. 香豆素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用,2017,29(10):1564-1568.

[19] 丁芳林, 張雯杰, 陳波, 等. HPLC法測定黃芩提取物中4種主要活性成分的含量[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(3): 128-130.

[20] 宋麗潔. 黃芩提取物的質(zhì)量評價方法研究[D]. 濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué), 2015：54.

[21] 傅力明, 王亞坤, 張浩, 等. 熒光光譜法研究蛇床子素與β-環(huán)糊精及其衍生物的包合作用[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(5): 447-450.