龐 濤，陳萬生，陸文銓，唐 蕾

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院 藥學(xué)部(上海 200433)

腦缺血卒中是一組急性起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，包括腦梗塞、腦出血、腦供血不足及短暫性腦缺血發(fā)作等類型，是血管疾病中最常見的類型[1]，約占腦血管病的75%～90%[2-3]，腦缺血卒中具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點，嚴(yán)重危害人類的健康和生命。流行病學(xué)調(diào)查[4]發(fā)現(xiàn)，近年我國缺血性腦卒中發(fā)病率呈不斷上升趨勢。第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院自制制劑“益氣醒腦口服液”由黃芪、川芎、紅花、桃仁、丹參、珍珠母、膽南星、枳實、炙遠(yuǎn)志、石菖蒲和生地黃十一味中藥組成，以益氣活血法為主，在臨床治療缺血性腦卒中方面取得良好的效果。近年來由于治療時間窗“缺血半暗帶”概念的提出，超早期治療顯得尤為重要。由于該制劑申報時間較早，目前所用制劑工藝存在較大缺陷，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅檢測黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，對工藝考察有較大局限性。本研究擬采用正交試驗設(shè)計，以線栓法再灌注模型大鼠腦梗死面積、腦組織含水量、血腦屏障通透性、腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及腦組織病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)為評判標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選最佳提取工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 儀器

JA2003A型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；H-600透射電子顯微鏡，KY2000半自動生化分析儀(日本日立公司)；5415R離心機(jī)(德國Eppendrof公司)；1200LC高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 試藥

益氣醒腦口服液(中藥材采購自銅陵禾田中藥飲片有限公司，由第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院制劑室制備)；藥用酒精(太倉新太藥用酒精廠，批號：160601)；腦血康(山東昊福藥業(yè)集團(tuán)制藥有限公司，批號：20151106)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，批號：D15101402)；水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160426)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(BIO BASICINC，批號：LJ0508B1009J)；伊文思藍(lán)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160218)；甲醛溶液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160304)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111920-201505)；其余所用試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD雄性大鼠，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號碼：SCYK(滬)2013-0016；飼養(yǎng)條件：室溫20～25 ℃，濕度40%～70 %，標(biāo)準(zhǔn)飼料，動物自由飲食和飲水，光線12 h明暗自動轉(zhuǎn)換。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交設(shè)計觀察益氣醒腦口服液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響

水提醇沉法是廣泛應(yīng)用于中藥的提取方法，其操作方法簡單，生產(chǎn)成本低廉，適合規(guī)?；\(yùn)用。本實驗對工藝采用正交設(shè)計，以對中藥提取影響最大的提取加水量、提取時間、提取次數(shù)為影響因素，參照L9(34)設(shè)計正交實驗：加水量(A)為藥材總量的4、8、12倍；提取時間(B) 1、2、3 h，提取次數(shù)(C)1、2、3次；醇沉濃度(D)40%、60%、80%；以大鼠腦梗死面積、血腦通透性、損傷腦勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)變化、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝(表1)。

表1 正交影響因素設(shè)計

2.2 栓線法制備動物模型

實驗大鼠隨機(jī)分為12組，每組6只，提前7 d給藥；假手術(shù)組、模型對照組分別給予0.9%NaCl灌胃(3 mL/kg)；陽性對照組給予腦血康(45 mg/kg)；益氣醒腦1～9組分別給予不同提取工藝的益氣醒腦口服液(3 mL/kg)。第7天給藥1 h后，將大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中切口，分離、結(jié)扎左側(cè)頸總動脈近心端、頸外動脈及其分支動脈，根部結(jié)扎該分枝。分離左側(cè)頸內(nèi)動脈，沿頸內(nèi)動脈向下分離翼顎動脈，在頸內(nèi)動脈近端備線、遠(yuǎn)端放置動脈夾，頸總動脈分叉切口，插入栓線，深度為18 mm，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈，入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈所有血流來源。撤掉動脈夾，扎緊備線，外留1 cm長線頭，縫合皮膚。腦缺血2 h后，輕輕提拉所留線頭至頸總動脈切口處，血流再灌注[5-7]。假手術(shù)組除不插線處理外，其余步驟同上。術(shù)后放入籠中飼養(yǎng)觀察。各組在腦缺血后30 min灌胃給藥1次。腦缺血2 h再灌注24 h后對存活大鼠行TTC染色，采用Photoshop軟件計算腦梗死和全腦面積比例，計算腦組織含水量，生化分析儀測定血腦屏障通透性及腦組織SOD、MDA的影響。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2.4 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦梗死面積的影響結(jié)果

大鼠腦缺血2 h再灌注24 h腦組織出現(xiàn)梗死，模型組大鼠的腦梗死比例為(30.32±2.12)%；與模型組相比，益氣醒腦口服液各組和陽性對照組腦梗死比例均降低，其中益氣醒腦5組梗死比例為(18.25±1.86)%，益氣醒腦7組為(18.68±1.15)%，益氣醒腦9組為(18.41±3.07)%，陽性對照組為(19.1±1.78)%，與其他治療組相比療效最佳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 各組大鼠缺血性再灌注后腦組織梗死面積結(jié)果注：與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.5 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦組織含水量的影響結(jié)果

大鼠缺血再灌注損傷后出現(xiàn)腦水腫，腦組織含水量增加。模型組大鼠腦含水量明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，益氣醒腦1～9組和陽性對照腦血康組的腦組織含水量均不同程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但各組間差異不大，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖2 各組大鼠缺血性再灌注后腦大腦含水量結(jié)果注：與模型對照組比較，*P<0.05

2.6 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血腦屏障通透性的影響結(jié)果

模型大鼠經(jīng)尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)-0.9%NaCl溶液(4 mL/kg)。注射2 h后，腹腔注射10%水合氯醛生理鹽水溶液(3 mL/kg)麻醉大鼠，打開胸腔，從左心室插入注射針頭，于右心耳部處剪一小口，向內(nèi)注入0.9%氯化鈉注射液，至右心耳流出液變清亮，打開顱腔取腦損傷部位約100 mg腦組織，加入3 mL甲酰胺中，50 ℃水浴72 h，1 500 rpm/min，離心10 min，上清液630 nm測定其OD值。

實驗結(jié)果顯示，模型對照組大鼠腦EB含量明顯高于假手術(shù)組；與模型組比較，益氣醒腦各組和陽性對照組(34.66±12.95)μg/g的腦組織EB含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示益氣醒腦口服液可有效降低缺血性再灌注模型大鼠的腦EB含量；益氣醒腦各組中，益氣醒腦5組為(36.64±19.80)μg/g，益氣醒腦7組為(36.86±9.21)μg/g，益氣醒腦9組為(32.45±12.30)μg/g，此3組減低程度最大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。

圖3 各組大鼠腦血腦屏障通透性EB含量的影響結(jié)果注：與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.7 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果

光鏡結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織皮層各神經(jīng)元層次清楚、排列整齊，未見水腫及出血，腦內(nèi)神經(jīng)元核仁清晰，神經(jīng)細(xì)胞無腫脹，間質(zhì)小血管無充血和水腫。模型組大鼠梗塞側(cè)腦組織皮層結(jié)構(gòu)排列紊亂、神經(jīng)元腫脹，出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤，血管周圍間隙擴(kuò)大，細(xì)胞周圍明顯水腫；神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞呈皺縮狀、細(xì)胞核固縮消失；益氣醒腦1～9組和陽性對照組大鼠梗塞側(cè)腦組織病理改變有不同程度減輕，部分神經(jīng)元呈不規(guī)則形態(tài)，神經(jīng)元皺縮，細(xì)胞核濃染，細(xì)胞周圍間隙增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血減輕。其中益氣醒腦5組大部分突觸泡正常，少量輕度擴(kuò)張，但前后膜結(jié)構(gòu)較清晰，神經(jīng)元細(xì)胞未見脂褐素顆粒，血管正常；益氣醒腦7組神經(jīng)元細(xì)胞染色質(zhì)分布較為均勻，血管結(jié)構(gòu)較為正常，較益氣醒腦其他各組效果更好(圖4)。

圖4 光鏡下大鼠閉合性顱腦損傷的腦組織病理形態(tài)學(xué)照片

2.8 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦組織SOD、MDA變化的結(jié)果

腦缺血2 h再灌注24 h后存活大鼠，用10%水合氯醛生理鹽水溶液(3 mL/kg)麻醉，取少量腦損傷部位腦組織，勻漿，測定SOD、MDA含量。結(jié)果顯示，各治療組與模型對照組比較，腦組織SOD的含量均有明顯上升：陽性對照組、益氣醒腦5組、益氣醒腦7組、益氣醒腦9組nmol/mgprot，以上4組腦組織SOD含量上升程度較其他各治療組更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

各治療組與模型對照組比較，腦組織MDA的含量均下降：陽性對照組(11.82±7.29) nmol/mgprot，益氣醒腦5組、益氣醒腦7組、益氣醒腦9組nmol/mgprot，以上四組腦組織MDA含量下降幅度較大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織SOD、MDA變化的結(jié)果

注：與模型對照組比較，*P<0.05

2.9 各益氣醒腦組毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測結(jié)果

各益氣醒腦組毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測采用色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相以乙腈為A相，0.2%甲酸溶液為B相，梯度洗脫(0～0.5 min,5%～10%A;0.5～22.0 min,10%～18%A),檢測波長為250 nm,流速1 mL/min;柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷計算應(yīng)不低于5 000。

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，用20%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中含20 μg的溶液，即得。精密量取各組益氣醒腦口服液10 mL，離心(14 000 r/min)5 min，取上清液2 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，每個樣品測定3次。專屬性試驗、精密度考察(RSD 0.11%)、重復(fù)性考察(RSD 5.74%)、穩(wěn)定性試驗(RSD 2.19%)、 加樣回收率(93.40%，RSD 3.59%)。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在Y=44.15X-16.20(R2>0.999 9)，即3.30～132.00 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，雜質(zhì)及基質(zhì)對益氣醒腦口服液的含量測定無影響，符合定量分析要求。

結(jié)果顯示，益氣醒腦5組、益氣醒腦6組、益氣

醒腦7組和益氣醒腦9組毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較其他各組高。結(jié)合正交設(shè)計發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醇沉濃度達(dá)到80%時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量明顯大幅度降低，而60%的醇沉濃度較40%的醇沉濃度，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量雖有降低，但幅度不大，而用40%乙醇醇沉后，液體較為渾濁，沉淀較多影響成品質(zhì)量，故采用60%乙醇醇沉處理(圖6)。

圖6 益氣醒腦各組毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測結(jié)果

2.10 提取工藝優(yōu)化結(jié)果

正交試驗結(jié)果顯示，益氣醒腦5組、益氣醒腦7組和益氣醒腦9組綜合藥效結(jié)果較佳，考慮到益氣醒腦口服液為中藥口服液，需保證液體澄明度，而益氣醒腦5組、益氣醒腦9組的液體澄明度較益氣醒腦7組沉淀較多，液體較為渾濁，故結(jié)合藥效結(jié)果，選定益氣醒腦7組工藝條件，即正交組合A3B1C3D2為最優(yōu)提取工藝。

2.11 3批中試樣品藥學(xué)效實驗驗證

根據(jù)上述工藝擴(kuò)大10倍量，生產(chǎn)3批中試樣品，通過缺血性再灌注大鼠模型的以腦梗死面積、腦組織含水量、血腦屏障通透性、腦組織SOD、MDA、樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量和病理切片，考察提取工藝的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，按篩選的最優(yōu)工藝提取的益氣醒腦口服液，藥效明確，質(zhì)量穩(wěn)定，適合作為本制劑的提取工藝(表2、圖7)。

表2 3批中試樣品的結(jié)果

注：與模型對照組比較，*P<0.05

圖7 3批中試樣品的病理切片結(jié)果

3 討論

大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)是臨床上缺血性腦血管疾病的易患部位，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，神經(jīng)功能行為異常、腦梗死面積增大、腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變是腦缺血再灌注導(dǎo)致腦損傷的主要表現(xiàn)，是研究急性缺血性腦中風(fēng)發(fā)病機(jī)制的首要問題[8]。從中醫(yī)角度認(rèn)識中風(fēng)病的病因，其一與“氣滯血瘀”有關(guān)，類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺血性腦血管??；二是認(rèn)為與風(fēng)、火、痰有關(guān)，如肝風(fēng)內(nèi)動、肝火上炎、風(fēng)火挾痰，類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)出血性腦血管病[9]。隨著我國中藥配方的不斷科學(xué)化、合理化，中藥成為治療中風(fēng)病的主要途徑之一，益氣醒腦口服液對治療中風(fēng)病療效確切。中醫(yī)傳統(tǒng)復(fù)方的開發(fā)是現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)化研究的熱點，工藝研究是其難點之一[10]。由于中藥組成復(fù)雜，藥效成分尚未進(jìn)行深入研究，有學(xué)者認(rèn)為，目前多數(shù)研究采用單一的指標(biāo)物質(zhì)來衡量一個復(fù)方中藥制劑的療效存在客觀片面性。因此，本研究嘗試采用正交試驗設(shè)計，評價模型大鼠腦梗死面積、腦組織含水量、血腦屏障通透性、腦組織SOD、MDA及腦組織病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)，為優(yōu)選益氣醒腦口服液的最佳提取工藝條件提供科學(xué)方法。

本研究通過再灌注損傷的大鼠模型，以腦梗死面積、腦組織含水量、血腦屏障通透性[11-12]、腦組織SOD、MDA及腦組織病理形態(tài)學(xué)[13]結(jié)合有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量來評判工藝優(yōu)越性，可以有效規(guī)避這一缺陷。本研究顯示，以提取時間為3 h，加12倍量水提取1次，60%乙醇醇沉(即A3B1C3D2)對大鼠再灌注損傷的大鼠模型療效確切，顯著優(yōu)于其他制備工藝，是益氣醒腦口服液的最佳工藝條件，通過三批樣品在缺血性再灌注大鼠模型上的實驗結(jié)果也顯示工藝穩(wěn)定，同時也符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對于樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量要求(>50 μg/mL)。受限于本研究樣本量較小，尚需大量樣本進(jìn)一步研究。

綜上所述，應(yīng)用提取時間為3 h，加12倍量水提取1次，60%乙醇醇沉可顯著改善益氣醒腦口服液的療效，同時保證其產(chǎn)品質(zhì)量。

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