武敬參，沈昊昊，吳壽全，王 羽，吉桂宜，賀建清

1.四川大學華西醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科(成都 610041)；2.河南大學淮河醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科 (開封 475001)； 3.河南大學淮河臨床學院(開封 475001)；4. 四川大學華西臨床醫(yī)學院(成都 610041)

結核病是一種病因明確、可防可治的疾病，抗結核藥物治療是控制結核分枝桿菌播散及結核病流行的最有效手段[1]，常見的一線抗結核藥物主要包括異煙肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)、乙胺丁醇(E)等。隨著WHO在全球推廣直接督導短程化療策略，抗結核治療周期長及抗結核藥物的聯合應用，均可導致抗結核藥物所導致的副作用概率增加，其中以肝功能損害最為常見[2]。當患者出現肝功能異常或者相應臨床癥狀時，常常導致藥物劑量減少或藥物種類減少，甚至是療程中斷，從而影響治療效果，以及抗結核藥物耐藥性的產生[3]。如何順利地完成標準化抗結核治療方案，同時減輕或者避免肝損害是抗結核治療成敗的關鍵。因此，了解和掌握抗結核藥物致肝功能損害(anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity, ATDH)的發(fā)病機制至關重要。近年來，越來越多的研究[4-6]表明，基因多態(tài)性與ATDH的易感性有關聯，谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferase, GST)存在多種組織特異性表達同工酶，其中，GSTM1和GSTT1基因位點具有多態(tài)性，與ATDH易感性有一定關聯性，但這些研究重復性欠佳，且結果并不一致[7]。本實驗為前瞻性研究，旨在進一步探討在中國人群中GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與ATDH易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入標準：1)年齡16～80歲；2)明確診斷為“結核病”患者，包括病理確診、病原學確診和臨床診斷的患者；3)抗癆前肝功正常；4)自愿，并簽署知情同意書。排除標準：1)抗癆前肝功異常；2)患有可引起肝功能異常的其他疾病者，包括酒精性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、免疫性溶血性疾病、充血性心力衰竭等；3)服用其他可引起肝功能異常的藥物者，包括免疫抑制劑、抗腫瘤藥物、對乙酰氨基酚、氯丙嗪等；4)因肝功能損害以外的其他原因未完成3個月抗結核治療者。按照上述標準納入2012年10月至2014年12月四川大學華西醫(yī)院的結核病患者。

1.2 資料登記

登記患者的年齡、性別、身高、體質量、吸煙史、飲酒史、主要現病史(包括服用免疫抑制劑情況、病毒性肝炎情況、是否患有腫瘤以及是否有HIV感染等)、既往史、診斷依據、抗結核治療方案、隨訪時情況(包括隨訪時間、隨訪時療效評估及相應檢查結果)。實施標準聯合抗結核治療方案至少3個月，治療方案基本一致：2HREZ / 4～7HRE(即強化期為2個月，鞏固期4～7個月)，藥物劑量一致，H：300 mg，qd；R：450 mg，qd；E：750 mg，qd；Z：750 mg，bid。在此3個月期間，分別于服用抗結核藥物2、4周和2、3月時復查肝功能，并登記。

1.3 肝損害診斷標準

根據《臨床結核病學》[8]，本研究采取的診斷標準為：ALT ≥80 U/L(2倍參考范圍上限)或者TBIL ≥38 mol/L(2倍參考范圍上限)。對于ATDH的診斷，統(tǒng)一采用《RUCAM簡化評分系統(tǒng)》對每1位納入病例組的研究對象進行評分，根據評分要求，總評分≥3分可診斷為ATDH。采用《RUCAM簡化評分系統(tǒng)》對24例肝功損害的結核病患者進行評分，最終評分結果總結：>8分的有18例，6～8分的5例，3～5分的僅有1例。從而得知，本研究所納入的24例病例組研究對象均滿足ATDH的診斷標準。按照本研究所采用的ATDH診斷標準，當患者發(fā)生肝功能損害時，即被納入到病例組，相反，如果在此期間沒有發(fā)生ATDH者，則被納入對照組(圖1)。

圖1 研究對象納入流程圖

1.4 研究方法

1.4.1 外周血DNA提取 本研究對符合納入標準的研究對象統(tǒng)一抽取外周靜脈血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝，并盡快進行離心(時間控制在2 h內，離心半徑8 cm，離心速度3 000 r/min，離心時間10 min)，分離血漿與血細胞。使用AxyPrep血基因組DNA小劑量試劑盒[康寧生命科學(吳江)有限公司]，按照說明書提取DNA，然后-20 ℃低溫保存以備用。

1.4.2GSTM1與GSTT1基因分型 根據先前的相關研究[9]，本研究所采用引物如下。用多重PCR技術同時擴增GSTM1與GSTT1基因，并以β球蛋白基因作為內對照(表1)。

表1 PCR引物

PCR反應體系的建立，根據說明書計算PCR反應體系中所需加入的試劑量，其反應體系的組成如下(表2)。多重PCR擴增條件為：95 ℃預變性2 min，然后經98 ℃變性10 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，進行39次循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。PCR產物經2.0 %瓊脂糖凝膠電泳分離后，在凝膠成像和分析系統(tǒng)上觀察并記錄結果。

1.4.3 基因型結果判定 電泳圖自下而上分別為GSTM1(215 bp)、β-球蛋白(268 bp)、GSTT1(480 bp)；Marker自下而上依次為100 、200、300、400、500、600 bp，其結果判定如下(圖2)。

表2 多重PCR反應液組成(50 μL反應體系)

圖2 多重PCR方法檢測GSTM1及GSTT1 基因缺失情況

注：1：GSTM1(-) 合并GSTT1(+)；2：GSTM1(+) 合并GSTT1(-)；3：GSTM1(+) 合并GSTT1(+)；4：GSTM1(-) 合并GSTT1(-)； 5： 陰性對照； 6：GSTM1(-) 合并GSTT1(-)；7：GSTM1(+) 合并GSTT1(+)； M：Marker

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般臨床資料分析

兩組患者在性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、結核病種類(肺內結核或肺外結核)以及治療方案(含Z或不含Z)間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，用藥前的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)及總膽紅素(TBIL)的值均在正常值范圍內,且兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；用藥后兩組患者血清ALT、AST間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩組TBIL間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者一般臨床資料分析

組別用藥前用藥后ALT/(U/L)AST/(U/L)TBIL/(μmol/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)TBIL/(μmol/L)病例組(n=24) 23(15～36) 22(20～34)11.4(8.4～13.5)172(110.8～254.8) 83(69～201)12.8(7.7～19.3)對照組(n=223)17(11.2～24)22(18～27.5)10.2(7.6～14.1)24(16.7～34.4)26(20～34.2)9.1(6.2～12.6)P0.0950.1470.950<0.001<0.0010.073

2.2 GSTM1、GSTT1基因型與ATDH易感性的關系

在病例組及對照組中，GSTM1基因缺失的頻率分別為58.33%和52.47%，兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.668)；兩組中GSTT1基因缺失的頻率分別為45.83%和51.12%，兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.674)(表4)。

表4 GSTM1、GSTT1基因型與ATDH易感性的關系[n(%)]

2.3 GSTM1、GSTT1不同基因型組合與ATDH的關系

將GSTM1和GSTT1兩個基因進行組合，并將GSTM1(+)合并GSTT1(+)組合作為參照。結果表明，GSTM1(-)合并GSTT1(-)組合、GSTM1(+)合并GSTT1(-)組合、GSTM1(-)合并GSTT1(+)組合在兩組中出現的頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表5)。

表5 GSTM1、GSTT1不同基因型組合與ATDH易感性的關系

3 討論

GST是一種Ⅱ相解毒酶，在藥物經肝臟代謝過程中起著重要的作用[10]。GST可以消除細胞內自由基，從而減輕藥物的肝細胞毒性。該酶存在多種組織特異性表達同工酶，其中，GSTM1和GSTT1基因位點具有多態(tài)性，當發(fā)生基因突變純合子缺失時，可使GST活性喪失，增加ATDH的發(fā)生概率[11]。

目前，國內外已有關于基因GSTM1、GSTT1多態(tài)性與ATDH易感性的相關性研究報道。1項關于中國漢族兒童結核病的研究[12]表明，GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性與ATDH的易感性無關，該項研究試驗組20例，對照組143例，是首次關于中國漢族兒童結核病患者的相關研究。另1項研究[13]表明，GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族結核病患者ATDH之間也無明顯相關性，該研究試驗組89例，對照組1 858例。另外，多項研究[14-19]均支持GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性不增加ATDH的風險，但是也有研究[20]表明，GSTM1缺失基因型與ATDH的風險增加有關，其風險系數為2.13，而GSTT1基因型與肝損害的發(fā)生差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，對ATDH的發(fā)生無預測作用。出現上述結論不完全一致的可能原因有：1)結核病患者的納入標準不同；2)ATDH診斷標準不同；3)所研究的人群不同(不同國家、不同民族、不同年齡段等)；4)抗結核藥物的治療方案及劑量有所不同等。

總之，國內外關于基因GSTM1和GSTT1多態(tài)性與ATDH易感性的大量研究均表明兩者并無相關性。本研究采用嚴格的前瞻性研究策略，更加貼近臨床事實，同樣得出上述結論，且本研究人群中GSTM1和GSTT1基因缺失的發(fā)生頻率均在文獻報道的范圍內。雖然國內外的大多數研究表明，GSTM1和GSTT1基因缺失與ATDH的易感性無關，但仍有研究結論與此結論不一致，并且理論上GSTM1、GSTT1無效基因型會影響酶的活性，從而增加肝功能損害風險。因此，兩者有無關聯性的結論目前還難以得出，仍需要進一步深入研究。

另外，本研究還存在一定的局限性：1)樣本量不足，是造成本研究結論可能出現偏倚的最大原因；2)本研究所得出的結果是對吸煙、飲酒、BMI進行了多因素Logistic回歸校正，但是沒有對吸煙、飲酒的具體情況進行亞組分析；3)雖然對本研究的所有人員統(tǒng)一進行了培訓，但隨訪偏倚仍然是不可避免的混雜因素。因此，下一步在肝損傷相關研究過程中，有望采用相同標準，對不同種族之間的結核病患者進行量化深入研究，并擴大樣本量，使用更為科學的基因檢測手段及統(tǒng)計學方法；另外，目前尚缺乏全基因組關聯分析研究數據，它主要是用于篩選與疾病發(fā)生相關的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，能夠有效的識別與ADTH有關的基因變異因素[21]，如能用于臨床，就能夠鑒別關于某種藥物的敏感群體。在上述研究基礎上，應該加強前瞻性研究，獲得更加有說服力的結論，以期用于指導臨床醫(yī)生用藥，減少ATDH發(fā)生率，提高抗結核治療的安全性及有效性。

綜上所述，GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與ATDH易感性可能無關，即基因GSTM1與GSTT1的缺失情況可能不增加ATDH風險。

[1]Mitchison D, Davies G. The chemotherapy of tuberculosis: past, present and future[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2012, 16(6): 724-732.

[2]Wang L, Zhang H, Ruan Y,etal. Tuberculosis prevalence in China, 1990-2010; a longitudinal analysis of national survey data[J]. Lancet, 2014, 383(9934): 2057-2064.

[3]中華醫(yī)學會結核病學分會. 抗結核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2013, 36(10):732-736.

[4]Xiang Y, Ma L, Wu W,etal. The incidence of liver injury in Uyghur patients treated for TB in Xinjiang Uyghur autonomous region, China, and its association with hepatic enzyme polymorphisms nat2, cyp2e1, gstm1 and gstt1[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e85905.

[5]朱冬林, 席云, 吳雪瓊.GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性與抗結核藥物性肝損害的關系[J]. 中國抗生素雜志, 2011, 36(11): 864-868.

[6]Liu F, Jiao A X, Wu X R,etal. Impact of glutathione S-transferase M1 and T1 on anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity in Chinese pediatric patients[J]. PLoS One, 2014, 9(12): e115410.

[7]Sun F, Chen Y, Xiang Y,etal. Drug-metabolising enzyme polymorphisms and predisposition to anti-tuberculosis drug-induced liver injury: a meta-analysis[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2008, 12(9): 994-100.

[8]唐神結. 臨床結核病學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社, 2011: 547.

[9]Xiang Y, Ma L, Wu W,etal. The incidence of liver injury in Uyghur patients treated for TB in Xinjiang Uyghur autonomous region, China, and its association with hepatic enzyme polymorphisms nat2, cyp2e1, gstm1 and gstt1[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e85905.

[10] Strange R C, Jones P W, Fryer A A. Glutathione S-transferase: genetics and role in toxicology[J]. Toxicol Lett, 2000, 112-113: 357-363.

[11] Tang N, Deng R, Wang Y,etal.GSTM1 andGSTT1 null polymorphisms and susceptibility to anti-tuberculosis drug-induced liver injury: a meta-analysis[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2013, 17(1): 17-25.

[12] Liu F, Jiao A X, Wu X R,etal. Impact of glutathione S-transferase M1 and T1 on anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity in Chinese pediatric patients[J]. PLoS One, 2014, 9(12): e115410.

[13] Xiang Y, Ma L, Wu W,etal. The incidence of liver injury in Uyghur patients treated for TB in Xinjiang Uyghur autonomous region, China, and its association with hepatic enzyme polymorphisms nat2, cyp2e1, gstm1 and gstt1[J]. PLoS One,2014, 9(1): e85905.

[14] Wang T, Yu H T, Wang W,etal. Genetic polymorphisms of cytochrome P450 and glutathione S-transferase associated with antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in Chinese tuberculosis patients[J]. J Int Med Res, 2010, 38(3): 977-986.

[15] Tang S W, Lv X Z, Zhang Y,etal. CYP2E1,GSTM1 andGSTT1 genetic polymorphisms and susceptibility to antituberculosis drug-induced hepatotoxicity: a nested case-control study[J]. J Clin Pharm Ther, 2012, 37(5): 588-593.

[16] Chatterjee S, Chakrabarti S, Sengupta B,etal. Prevalence of CYP1A1 and GST polymorphisms in the population of northeastern India and susceptibility of oral cancer[J]. Oncol Res, 2009, 17(9): 397-403.

[17] Teixeira R L, Morato R G, Cabello P H,etal. Genetic polymorphisms of NAT2, CYP2E1 and GST enzymes and the occurrence of antituberculosis drug-induced hepatitis in Brazilian TB patients[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2011, 106(6): 716-724.

[18] Monteiro T P, El-Jaick K B, Jeovanio-Silva A L,etal. The roles ofGSTM1andGSTT1null genotypes and other predictors in anti-tuberculosis drug-induced liver injury[J]. J Clini Pharm Ther, 2012, 37(6): 712-718.

[19] Kim S H, Kim S H, Yoon H J,etal.GSTT1 andGSTM1 null mutations and adverse reactions induced by antituberculosis drugs in Koreans[J]. Tuberculosis(Edinb), 2010, 90(1): 39-43.

[20] Roy B, Chowdhury A, Kundu S,etal. Increased risk of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in individuals with glutathione S-transferase M1'null'mutation[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2001, 16(9): 1033-1037.

[21] 尚軍亮. 全基因組單核苷酸多態(tài)性交互作用研究[D]. 西安：西安電子科技大學, 2013:148.