苗 強(qiáng)，鄒遠(yuǎn)高， 白楊娟，唐江濤，劉 婕，王蘭蘭

四川大學(xué)華西醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科(成都 610041)

6-巰基嘌呤(6-MP)及其前體藥物硫唑嘌呤(AZA)屬于抗代謝藥物，該類藥物治療窗窄，不良反應(yīng)嚴(yán)重[1-3]，臨床應(yīng)用時(shí)常需實(shí)行治療藥物濃度監(jiān)測(cè)(therapeutic drug monitoring ，TDM)[4-6]。目前，已報(bào)道[7-9]的測(cè)定血漿中6-MP的方法，包括高效液相色譜法(HPLC)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)等。其中，HPLC和RP-HPLC法雖然成本低，但是有測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度不高的缺點(diǎn)，不適用于臨床檢測(cè)以及血漿中低濃度6-MP的測(cè)定。LC-MS/MS法采用二級(jí)質(zhì)譜定量，具有更好的專一性、準(zhǔn)確性，可用于人血漿中6-MP的低濃度測(cè)定，適用于臨床常規(guī)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)。本研究通過建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)檢測(cè)血漿6-MP濃度, 為進(jìn)一步考察其相應(yīng)代謝酶活性以及臨床及時(shí)掌握病情、評(píng)價(jià)療效和制定個(gè)體化給藥方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Waters公司超高效液相色譜(I-Class)-質(zhì)譜(TQ-S)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；賽多利斯BT125D電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；IKA MS3旋渦混勻器(德國(guó)IKA公司)；Eppendorf高速冷凍型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Milli-Q 超純水機(jī)(Millipore中國(guó)有限公司)。

1.2 藥品試劑

6-MP標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)6-硫鳥嘌呤(6-TG) (色譜純，Sigma-Aldrich公司)，乙腈、甲酸(色譜純，美國(guó)賽默飛世爾公司)，醋酸銨(分析純，Sigma-Aldrich公司)，甲醇、氨水(色譜純，中國(guó)成都科龍有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY BEH HILIC(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為pH 3.0, 0.02 mol/L醋酸銨緩沖液(含0.3%HCOOH)-乙腈(20∶80)，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量4 μL，柱溫40 ℃，總運(yùn)行時(shí)間1 min。以6-TG為內(nèi)標(biāo)。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源(ESI)技術(shù)，正離子掃描下的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)作為檢測(cè)模式。毛細(xì)管電壓2.0 kV，檢測(cè)離子6-MP m/z 153.03→119.1，碰撞能19 eV，錐電壓12 V；內(nèi)標(biāo)6-TG m/z 168.06→134.13，碰撞能和錐電壓分別為17 eV和10 V。去溶劑氣體溫度為400 ℃，去溶劑氣體流速800 L/h，錐氣體流速為150 L/h。

1.3.3 溶液配制 精密稱取6-MP標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制1 mg/mL的6-MP儲(chǔ)備液，置-20 ℃冰箱保存，備用。取6-MP儲(chǔ)備液1 mL，用甲醇∶水(1∶1, v/v)稀釋制成10 μg/mL的6-MP工作液，置于2～8 ℃保存。精密稱取內(nèi)標(biāo)6-TG標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并加入氨水，配制1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置-20 ℃冰箱保存，備用。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1 mL，用甲醇∶水(1∶1, v/v)稀釋制成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，置于2～8 ℃保存。

1.3.4 血漿樣品預(yù)處理 肝素抗凝全血，離心速度2 500 r/min，離心半徑18 cm，離心5 min，取血漿樣品200 μL加入40 μL內(nèi)標(biāo)(1 μg/mL)，再加入500 μL乙腈沉淀蛋白，旋渦混勻1 min，離心速度12 000 r/min，離心半徑9.5 cm，離心5 min，移取上清液至上樣瓶，進(jìn)樣4 μL。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿200 μL，按“1.3.4”方法處理后，加入相應(yīng)濃度的6-MP標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各適量，配制成5個(gè)不同濃度梯度的質(zhì)控樣本，將其進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積A；取相應(yīng)濃度的6-MP標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液直接混合，按照同樣的方法處理，以純水補(bǔ)足體積差，然后進(jìn)樣分析得相應(yīng)峰面積B，基質(zhì)效應(yīng)=A/B×100%。結(jié)果顯示，5個(gè)不同濃度梯度的質(zhì)控樣本基質(zhì)效應(yīng)分別為(119.74±6.33)%、(95.69±4.09)%、(95.51±7.76)%、(92.57±7.80)%、(102.34±6.37)%，RSD<10%，表明該方法不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與最低檢測(cè)限

取空白血漿、10 μg/mL的6-MP工作液適量，配制濃度為2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6 ng/mL的血漿樣品，按“1.3.4”方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)、待測(cè)物6-MP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重系數(shù)1/X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.010 525X+0.001 047 7，r=0.998 8。根據(jù)色譜圖和回歸方程分析結(jié)果，6-MP血漿藥物濃度在0.5～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其最低檢測(cè)限為0.125 ng/mL。

2.3 專屬性考察

在“1.3.1和1.3.2”項(xiàng)條件下，取20個(gè)體檢樣本血漿，不加入內(nèi)標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)取空白血漿+6-MP+內(nèi)標(biāo)，按“1.3.4”方法處理后，進(jìn)樣分析考察方法的專屬性。結(jié)果表明，6-MP和內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形良好，其保留時(shí)間分別為0.58 min和0.53 min，而20個(gè)體檢樣本血漿中未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性物質(zhì)干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，表明該方法專屬性良好(圖1)。

2.4 精密度與回收率試驗(yàn)

取空白血漿、相應(yīng)濃度的6-MP標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，配制濃度為1 000、125、15.6、2.0、0.5 ng/mL的質(zhì)控樣品，取每個(gè)濃度樣本各20份，按照“1.3.4”方法處理后，進(jìn)樣分析，考察方法的日內(nèi)精密度。另取每個(gè)濃度樣本5份進(jìn)行分析，連續(xù)測(cè)定5 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的測(cè)定濃度，考察方法的日間精密度。以測(cè)定的濃度與加入的濃度比值來考察樣品的方法回收率，已經(jīng)提取所得血漿樣品的色譜峰面積與未經(jīng)提取所得的色譜峰面積的比值來考察樣品的提取回收率。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間的RSD均<6%，各樣品的方法回收率89%～104%(RSD<6%)，提取回收率>95%(RSD<8%)。精密度與回收率的試驗(yàn)結(jié)果如下(表1)。

表1 精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白血漿、相應(yīng)濃度的6-MP標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，配制濃度為1 000、125、15.6、2.0、0.5 ng/mL的質(zhì)控樣品，分別考察其在室溫放置6 h、經(jīng)歷反復(fù)凍融(-20 ℃)(室溫)3次、-20 ℃冷凍保存15 d、自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)(16 ℃)放置72 h等條件下的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度取5份樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，RSD<10%(表2)。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣本測(cè)定

納入12例長(zhǎng)期服用AZA維持治療的炎癥性腸病患者，分別測(cè)定其血漿6-MP的濃度。由表可知，服用相同劑量的AZA，其血藥濃度存在明顯個(gè)體差異。其中，1例患者由于服藥后2 h內(nèi)采集血樣本，測(cè)定結(jié)果為峰濃度值60.42 ng/mL(表3)。

表3 服用AZA患者血漿中6-MP濃度

3 討論

巰嘌呤類藥物包括AZA、6-MP及6-TG，從20世紀(jì)80年代開始，巰嘌呤類免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用于炎癥性腸病和自身免疫性肝炎患者維持緩解的治療中[10-11]，并被證實(shí)具有良好療效。但由于基因多態(tài)性等多種因素原因，巰嘌呤類藥物的療效和安全性個(gè)體差異較大，不同患者對(duì)相同劑量的AZA應(yīng)答率不同，且對(duì)同等劑量AZA的藥物耐受性、副作用發(fā)生率也具有明顯差異，有必要進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測(cè)，對(duì)AZA進(jìn)行合理的劑量調(diào)整。6-MP血漿藥物濃度測(cè)定方法，文獻(xiàn)[8, 12-13]報(bào)道較多的是HPLC法，該法易受患者聯(lián)合用藥的干擾，檢測(cè)的線性范圍較窄，為20～2 000 ng/mL，分析時(shí)間需要7 min以上，靈敏度低，最低檢測(cè)限僅能達(dá)到20 ng/mL。本試驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS法，通過質(zhì)譜多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)來提升靈敏度，將線性范圍擴(kuò)展到0.5～2 000 ng/mL ，最低檢測(cè)限可達(dá)0.125 ng/mL。通過UPLC提高柱效將樣本的分析時(shí)間由原來的>7 min縮短至1 min，大大提高了檢測(cè)效率，同時(shí)串聯(lián)質(zhì)譜又較一級(jí)質(zhì)譜更能精確的檢測(cè)待測(cè)物，足夠滿足臨床合并用藥TDM監(jiān)測(cè)的需求。

3.1 血漿生物樣品處理方法

血漿樣本的處理方法會(huì)明顯影響測(cè)定結(jié)果，本研究考察了液-液萃取和沉淀蛋白兩類方法，在不同pH值條件下采用二氯甲烷進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品及內(nèi)標(biāo)回收率低。采用甲醇、乙腈作為蛋白沉淀劑去除蛋白，通過綜合比較色譜峰形、保留時(shí)間以及提取回收率，本研究選擇采用乙腈作為蛋白沉淀劑?？紤]到沉淀法對(duì)血樣處理不徹底，直接進(jìn)樣會(huì)污染質(zhì)譜儀，因此本研究考察了沉淀蛋白后直接進(jìn)樣分析與揮干濃縮復(fù)溶后進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)由于6-MP及內(nèi)標(biāo)溶解性的原因，采用純水、甲醇水、流動(dòng)相以及弱堿性純水復(fù)溶提取回收率均低，反而沉淀蛋白后直接進(jìn)樣分析的回收率相對(duì)較高，方法學(xué)評(píng)價(jià)中提取回收率>95%(RSD<8%)。因此，本實(shí)驗(yàn)樣品預(yù)處理方法最終選擇采用乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣分析。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在本實(shí)驗(yàn)中考察了Waters ACQUITY BEH C18 (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)和Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)色譜柱的分離效果和峰形，結(jié)果無(wú)論是否加預(yù)柱峰形均有分叉與拖尾現(xiàn)象，考慮到6-MP和內(nèi)標(biāo)的溶解性屬于極性物質(zhì)，嘗試采用Waters ACQUITY BEH HILIC(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)色譜柱，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，結(jié)果分離效果良好，峰形對(duì)稱。本研究在流動(dòng)相的選擇中對(duì)比了甲醇-水-甲酸和乙腈-水-甲酸兩種不同的系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-水-甲酸時(shí)，有色譜峰太寬和拖尾現(xiàn)象，乙腈-水-甲酸作為流動(dòng)相，峰形對(duì)稱，且峰寬較窄，進(jìn)一步對(duì)不同比例流動(dòng)相的峰形、保留時(shí)間等綜合分析，最終選擇流動(dòng)相比例為20∶80[pH3.0, 0.02 mol/L醋酸銨緩沖液(含0.3%HCOOH)-乙腈]，此時(shí)分離度良好，且保留時(shí)間適中。因此，本研究最終確定色譜條件：Waters ACQUITY BEH HILIC(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)色譜柱，流動(dòng)相為pH3.0, 0.02 mol/L醋酸銨緩沖液(含0.3%HCOOH)-乙腈(20∶80)，流速0.4 mL/min。

3.3 穩(wěn)定性分析

由于6-MP見光易分解，在整個(gè)提取過程中盡量避光操作，樣品貯存和上樣分析均采用棕色瓶。為了考察操作過程中的影響，進(jìn)行了室溫放置6 h的穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果不同濃度的樣品室溫放置6 h后進(jìn)樣分析RSD均<5%，且相對(duì)誤差(RE)均<8%。進(jìn)一步進(jìn)行了樣本檢測(cè)過程中穩(wěn)定性考察，即提取樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置72 h穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果其RSD與RE均<8%。在長(zhǎng)期穩(wěn)定性方面，6-MP血漿樣本可在-20 ℃穩(wěn)定保存15 d。因此，本研究中生物樣品在各種貯存條件下足夠穩(wěn)定，能夠滿足臨床及科研中藥物濃度監(jiān)測(cè)的要求。

本研究建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)血漿中6-MP濃度的方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，能為臨床提供可靠的測(cè)定結(jié)果，適用于血漿6-MP藥物濃度檢測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中測(cè)定了12例長(zhǎng)期服用AZA的炎癥性腸病患者血漿6-MP濃度，結(jié)果6-MP的血漿濃度存在明顯個(gè)體差異，結(jié)合AZA藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，其達(dá)峰時(shí)間約為1.5 h，故測(cè)定6-MP血漿濃度時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制采血時(shí)間點(diǎn)，以更好地反映患者體內(nèi)血漿6-MP的濃度。

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