,

1.北京豐臺醫(yī)院眼科,北京 100071; 2.北京同仁醫(yī)院眼科,北京 100730

先天性晶狀體半脫位是由于晶狀體懸韌帶先天發(fā)育異常,使得懸韌帶部分或全部缺損,引起對晶狀體的懸掛力不平衡或喪失,導(dǎo)致晶狀體離開正常的生理位置,引起視力下降,可合并高度近視或遠視等。先天性晶狀體半脫位是一種結(jié)締組織疾病,具有明顯的遺傳傾向,可以常染色體顯性或常染色體隱形遺傳模式進行遺傳。已經(jīng)證實FBN1基因突變是先天性晶狀體半脫位常染色體顯性遺傳的致病基因[1];而常染色體隱形遺傳的先天性晶狀體半脫位與ADAMTSL4基因突變相關(guān)[2]。本研究對三個先天性晶體半脫位家系進行致病基因的研究,發(fā)現(xiàn)這三個家系所有患者均存在FBN1基因不同位點的錯義突變。現(xiàn)報道如下。

1 研究對象

選擇2014年2月—2014年9月在北京同仁醫(yī)院白內(nèi)障中心就診的三個先天性晶狀體半脫位家系,包括14例患者,男6例,女8例,年齡4～62歲和3名正常家系成員。通過詢問家系成員病史和家族史,眼科及其他相關(guān)科室協(xié)助會診,依據(jù)2010年修訂版Ghent的疾病分類學(xué)標準進行臨床診斷[3]。眼科檢查包括視力,裂隙燈顯微鏡檢查有無晶狀體、晶狀體狀態(tài)及脫位的范圍等。X線檢查患者脊柱及四肢骨骼,彩色超聲心動圖排除心臟主動脈瘤樣擴張疾病。本研究遵循赫爾辛基宣言,所有患者均知情同意。

1.1 方法

分別采集Ⅰ號家系(圖1)10例患者及1名表型正常個體外周靜脈血5 mL;Ⅱ號家系(圖2)3例患者及1名表型正常個體外周靜脈血5 mL;Ⅲ號家系(圖3)1例患者與1名表型正常個體外周靜脈血5 mL。EDTA抗凝,使用康為世紀通用型柱式基因組提取試劑盒提取樣本DNA。

1.2 高通量FBN1基因測序[4]

利用目標基因捕獲技術(shù)(北京中科檢驗),采取設(shè)計好的基因捕獲探針與基因組DNA文庫混合,對FBN1基因外顯子區(qū)域進行捕獲。目標區(qū)域基因片段被雜交到探針上,進而通過生物素和鏈霉親和素的磁珠結(jié)合被吸附到磁珠上,通過洗脫處理將非目標區(qū)域的DNA片段洗掉,得到目標基因。采用Covaris S2超聲儀將樣本進行超聲片段化。末端補平:分別取75 μL片段化的DNA、End Repair Reaction Buffer 14 μL、End Repair Enzyme Mix 11 μL(Mygenostics公司),總體積100 μL。20 ℃孵育30 min。用Beckman Ampure beads 按1.8∶1 體積比例(beads:反應(yīng)體積)對產(chǎn)物進行純化。片段兩端加A(A-Tailing):末端補平純化洗脫32 μL DNA、A-Tailing Reaction Buffer 15 μL、A-Tailing Enzyme Mix 3 μL(Mygenostics公司),總體積50 μL反應(yīng)體系,37 ℃孵育30 min。產(chǎn)物采用Beckman Ampure beads 按1.8∶1體積比例(beads:反應(yīng)體積)進行純化。連接adaptor:A-Tailing 產(chǎn)物純化洗脫27 μL DNA、Ligation Reaction Buffer 40 μL 、Ligation Enzyme Mix 30 μL(Mygenostics公司),總體積 97 μL反應(yīng)體系,25 ℃孵育10 min。產(chǎn)物采用Beckman Ampure beads 按1.8∶1體積比例(beads:反應(yīng)體積)進行純化。將1 μg已制備好的文庫的與BL緩沖液和設(shè)計的探針混合(表述不清),95 ℃加熱7 min,65 ℃加熱2 min;加入23 mL預(yù)熱至65 ℃的HY緩沖液,65 ℃雜交22 h。用500 μL 1×結(jié)合緩沖液沖洗50 μL磁珠3次,63 μL 2×結(jié)合緩沖液至雜交混合物中,轉(zhuǎn)移至含有80 μL磁珠的試管中。旋轉(zhuǎn)混勻1 h。用 WB1緩沖液室溫清洗磁珠15 min。然后用洗脫緩沖液將結(jié)合的DNA洗脫下來。洗脫的DNA進行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件如下:98 ℃預(yù)變性30 min;98 ℃變性20 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共進行9個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min,4 ℃延伸10 s。PCR產(chǎn)物采用Beckman Ampure beads 按1.8∶1 體積比例(beads:反應(yīng)體積)進行純化。采用取3 μL制備好的文庫樣本,做1%的瓊脂糖凝膠電泳實驗,電泳結(jié)果片段在300～500 bp的區(qū)域條帶。利用HiSeq 2000高通量測序。利用Trim-Galore程序過濾低質(zhì)量的序列,保留讀出質(zhì)量大于20 μL和讀取長度大于80 bp的序列,然后使用GATK軟件包對質(zhì)量值進行校準,利用CCDS、人基因組數(shù)據(jù)庫(HG19)、dbSNP(v144)信息對SNP進行注釋,注釋完成的數(shù)據(jù)再進一步比對HGMD、ClinVar、OMIM、UniProt等數(shù)據(jù)庫進行分析并且針對每個位點進行文獻確認。

圖2 Ⅱ號家系先天性晶體半脫位家系圖Fig.2 The pedigree of congenital lens subluxation of the family Ⅱ

圖3 Ⅲ號家系先天性晶體半脫位家系圖Fig.3 The pedigree of congenital lens subluxation of the family Ⅲ

圖1 Ⅰ號家系先天性晶體半脫位家系圖Fig.1 The pedigree of congenital lens subluxation of the familyⅠ

1.3 Sanger法測序及驗證

FBN1和ADAMTSL4基因編碼區(qū)引物序列通過軟件Oligo設(shè)計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。FBN1和ADAMTSL4基因外顯子擴增,取5 μL擴增產(chǎn)物與0.5 μL 10×loading buffer混勻后,點樣到含Glod View的1%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證,同時加入DNA Marker作為對照,在凝膠成像系統(tǒng)中鑒定擴增結(jié)果,通過對照DNA Marker 各片段位置和亮度來鑒定PCR產(chǎn)物片段的大小和濃度。采用試劑盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)柱法回收目標DNA進行凝膠電泳檢測,測序產(chǎn)物進行擴增(使用試劑盒Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit),測序產(chǎn)物進行純化,應(yīng)用ABI 3730XL自動測序儀完成測序。測序結(jié)果錄入Chromas及DNAStar軟件進行序列比對,經(jīng)鑒定出的突變再進行反向測序進一步驗證明確。

2 結(jié)果

2.1 FBN1基因

目標基因捕獲結(jié)合高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn):Ⅰ號家系長期生活在我國河北,是一個常染色體顯性遺傳三代家系,成員共25名,患者10例,先證者為1例8歲患兒。家系所有患者的FBN1基因第38號外顯子mRNA第4588位堿基均出現(xiàn)C→T雜合錯義突變,即c.4588C>T,導(dǎo)致了第1530編碼子編碼的野生型精氨酸被突變型半胱氨酸替代,使第1530編碼子發(fā)生了p.R1530C的突變(圖4)。Ⅱ號家系長期生活在我國河北,是一個常染色體顯性遺傳三代家系,先證者為1例4歲患兒,3例患者的FBN1基因第40號外顯子mRNA第4864堿基均出現(xiàn)T→C雜合錯義突變,即c.4864T>C,導(dǎo)致了第1622編碼子編碼的野生型半胱氨酸被突變型精氨酸替代,使第1622編碼子發(fā)生了p.C1622R的突變(圖5)。Ⅲ號家系長期生活在我國山東,2例患者,其中1例已確診患者病逝,先證者為1例28歲女性,其FBN1基因第16號外顯子mRNA第1883位堿基出現(xiàn)G→A雜合錯義突變,即c.1883G>A,導(dǎo)致了第628編碼子編碼的野生型半胱氨酸被突變型酪氨酸替代,使第628編碼子發(fā)生了p.C628Y的突變(圖6)。分別設(shè)計引物擴增后進行Sanger法測序,測序結(jié)果相同。家系正常個體,本地正常人數(shù)據(jù)庫及1 000人基因數(shù)據(jù)庫中均無此類突變。經(jīng)Polyphen程序分析:Ⅰ號家系精氨酸被半胱氨酸替代后所得的PSIC值為0.998;Ⅱ號家系半胱氨酸被精氨酸替代后所得的PSIC值為0.999;Ⅲ號家系半胱氨酸被酪氨酸替代后所得的PSIC值為0.998,均提示野生型氨基酸被突變型氨基酸替代后,均引起FBN1蛋白結(jié)構(gòu)及功能的破壞。

圖4 突變型 Ⅰ號家系先證者的FBN1基因38號外顯子部分測序結(jié)果(檢測到突變:4588C>T)Fig.4 Identification of 4588C>T mutation in FNB1 exon 38

圖5 突變型 Ⅱ號家系先證者的FBN1基因40號外顯子部分測序結(jié)果(檢測到突變:4864T>C)Fig.5 Identification of 4864T>C mutation in FNB1 exon 40

圖6 突變型 Ⅲ號家系先證者的FBN1基因16號外顯子部分測序結(jié)果(檢測到突變:1883G>A)Fig.6 Identification of 1883G>A mutation in FNB1 exon 16

2.2 ADAMTSL4基因

Sanger法測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個家系3例先證者ADAMTSL4基因均有不同外顯子mRNA核酸位點的改變,但對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能沒有改變,均為單核苷酸多態(tài)性改變(SNP),見表1。

3 討 論

本研究中,使用了目標基因捕獲技術(shù)聯(lián)合高通量測序再結(jié)合Sager法驗證基因檢測結(jié)果的方法進行基因突變的篩查,這種方法能快速、準確、高通量、低成本地對單基因多個外顯子或多個基因同時測序,大大提高了基因測序的效率、降低了成本,今后還可以用在大樣本量的疾病已知基因檢測中,使我們對分子病因?qū)W有更好的認識。

本研究中,確定了三個常染色體顯性遺傳的先天性晶狀體半脫位家系。三個家系所有患者均表現(xiàn)為雙眼晶狀體向顳側(cè)半脫位,經(jīng)彩色多普勒超聲心動圖及骨骼X線檢查,僅Ⅰ號家系3例患者身高超過1.90 cm,雙手指細長,其他體征正常,彩色超聲心動圖未見異常。先天性晶狀體半脫位與馬凡綜合征(MFS)均可以表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,在臨床表型和基因型上均有一定程度的重疊性,有較高的外顯性,同時又表現(xiàn)各異。先天性晶狀體半脫位通常會有一些MFS的骨骼表現(xiàn),但缺乏主動脈相關(guān)性疾病是其重要特征。依據(jù)修訂版Ghent確診馬凡綜合征(MFS)需要心臟、骨骼、眼三個系統(tǒng)受累,其中兩個系統(tǒng)符合主要診斷標準,主動脈根部的擴張視為診斷的首要標準,更為強調(diào)結(jié)合心血管、骨骼系統(tǒng)、晶狀體異位累及的程度、家族史和是否攜帶突變基因來綜合診斷,而其他的臨床表現(xiàn)如單純性晶狀體半脫位或合并骨骼系統(tǒng)的表現(xiàn)均不屬于MFS。對候選基因FBN1及ADAMTSL4進行側(cè)序,發(fā)現(xiàn)所有患者FBN1基因均存在雜合性錯義突變,在蛋白層一級結(jié)構(gòu)上分別導(dǎo)致了野生型的氨基酸殘基被新的氨基酸殘基所取代,而正常者未發(fā)現(xiàn)此突變。ADAMTSL4基因僅發(fā)現(xiàn)四個SNP位點,尚無相關(guān)致病性報道。FBN1基因定位于15號染色體15q21.1[5],全長約200 kb,是由65個外顯子和47個內(nèi)含子組成的復(fù)合多區(qū)域結(jié)構(gòu),其編碼序列長約10 kb,由多個重復(fù)性的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。目前經(jīng)UMD數(shù)據(jù)庫檢索已發(fā)現(xiàn)1 780多種基因突變,隨機分布在整個FBN1基因中,沒有明顯的熱點突變。FBN1蛋白在心血管系統(tǒng)、軟骨、角膜、晶狀體懸韌帶以及皮膚、腎等組織廣泛表達,是微纖維的重要組成部分[6],微纖維可調(diào)節(jié)組織中彈力蛋白之間及彈力蛋白與細胞外基質(zhì)的相互作用,對組織可起到支撐作用。先天性晶狀體脫位是由于晶狀體懸韌帶非對稱性的過度松弛,在病理學(xué)檢查時發(fā)現(xiàn)懸韌帶纖維不僅在數(shù)量上減少,而且直徑變細,形態(tài)不規(guī)則,與正常對照比較纖維無彈性,很容易斷裂。在結(jié)構(gòu)上,FBN1基因編碼的FBN1蛋白前體,是由2 871個氨基酸組成,其包含6個結(jié)構(gòu)域,其中類表皮樣生長因子結(jié)構(gòu)域(cb-EGF)與鈣離子的結(jié)合可以保護FBN1蛋白的桿狀結(jié)構(gòu),免于FBN1蛋白水解酶水解,鈣結(jié)合域的突變及半胱氨酸殘基的置換可引起FBN1蛋白前體結(jié)構(gòu)域的變化,從而導(dǎo)致功能障礙[8],患者發(fā)生晶狀體半脫位的概率相對較高。本研究三個家系患者:Ⅰ號家系患者FBN1基因38號外顯子堿基雜合錯義突變,導(dǎo)致第1530編碼子編碼的野生型精氨酸被突變型半胱氨酸替代,使其發(fā)生p.R1530C的突變;Ⅱ號家系患者40號外顯子堿基雜合錯義突變,導(dǎo)致了第1622編碼子編碼的野生型半胱氨酸被突變型精氨酸替代,使其發(fā)生p.C1622R的突變;Ⅲ號家系患者16號外顯子堿基雜合錯義突變,導(dǎo)致了第628編碼子編碼的野生型半胱氨酸被突變型酪氨酸替代,使其發(fā)生了p.C628Y的突變。本研究報道的這三個FBN1基因突變都位于原纖維蛋白-1鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,半胱氨酸與精氨酸及酪氨酸的替代導(dǎo)致二硫鍵不能結(jié)合,cb-EGF的鈣結(jié)合共有結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象發(fā)生改變,減弱了cb-EGF結(jié)合鈣的能力,影響野生型蛋白高級結(jié)構(gòu)的形成,干擾其功能。同時FBN1蛋白易于被降解,導(dǎo)致細胞外基質(zhì)微纖維結(jié)構(gòu)裂解,彈性纖維的穩(wěn)定性下降,懸韌帶的結(jié)構(gòu)功能受到嚴重的影響。

表1 3名先證者ADAMTSL4基因檢測結(jié)果Tab.1 Detection of ADAMTSL4 gene in 3 probands

ADAMTSL4基因位于1號染色體(1q21.2),長約11.5 kb,包括全部19個外顯子,mRNA為4 209 bp,由HEK293F細胞的轉(zhuǎn)染表達。純合及復(fù)合雜合ADAMTSL4基因突變是常染色體隱性遺傳先天性晶狀體半脫位的主要原因[9-12]。目前已報道了15種基因突變,大部分患者來自于歐洲民族,無義突變所導(dǎo)致的提前終止密碼子及錯義突變多見。ADAMTSL4蛋白質(zhì)的功能及眼部定位尚未完全建立,有相關(guān)研究結(jié)果表示,mRNA和蛋白編碼ADAMTSL4產(chǎn)物是一種分泌性糖蛋白,廣泛分布于眼球,證明在虹膜、脈絡(luò)膜、睫狀體及視網(wǎng)膜分布。有學(xué)者曾報道在17例單純晶狀體半脫位患者FBN1和ADAMTSL4基因型和表型的不同特證中闡述[13]:ADAMTSL4基因突變的患者臨床體征表現(xiàn)早,眼軸增長更明顯。ADAMTSL4基因產(chǎn)物參與細胞外基質(zhì)形成和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,ADAMTSL4蛋白結(jié)合原纖維蛋白1的微纖維,可加速微纖維生物合成,在形成小帶的過程中起到潛在的作用。本研究對家系中3例先證者的ADAMTSL4基因的檢測結(jié)果經(jīng)SSCP證實為單核苷酸多態(tài)性改變(SNP),而非基因突變。

通過蛋白的多重序列比對(采用DNASTAR軟件中的negAlign程序)了解一個基因家族的基本特征,尋找序列的保守性。我們發(fā)現(xiàn)FNB1基因編碼子1530、1622、628的野生型氨基酸在進化中高度保守,是斑馬、魚、雞、狗、小鼠、大猩猩及人類原纖維蛋白-1蛋白(FBN1)功能域中的重要結(jié)構(gòu)蛋白,此類蛋白的改變會引起物種基本特征的改變。

Polyphen程序(http://coo/enbl.elc/polyphen)是用來預(yù)測蛋白被替代后對其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害作用的工具,一般認為PSIC 值越接近1.0,損害可能性越大,越接近0,損害可能性越小,通過polyphen程序分析進行預(yù)測突變意義。本文計算的三個家系的PSIC值結(jié)果分別是0.998、0.999、0.998,提示基因的突變損害了FBN1蛋白的功能,是基因的致病性突變,而非SNP。

本研究只對三個晶狀體半脫位家系FBN1及ADAMTSL4兩個候選基因進行了遺傳學(xué)分析研究,樣本量較少,因此FBN1及ADAMTSL4基因突變與先天性晶狀體半脫位疾病的關(guān)系還有待進一步深入研究。

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