黃小麗，馮 楊，成 霞，汪開毓

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

雜交鱘（hybrid sturgeon），屬鱘形目（Acipenseriformes）、鱘科（Acipenseridae）、鱘屬（Acipenser）。養(yǎng)殖雜交鱘主要是施氏鱘（Acipenser schrencki）、西伯利亞鱘（Acipenser baeri）和俄羅斯鱘（ipenser guldenstadti）的雜交后代[1]，也有的為施氏鱘與東北鰉魚（Huso dauricus）或施氏鱘和西伯利亞鱘的雜交后代。雜交鱘因適應(yīng)性強、生長速度快、性成熟早、后代可育、遺傳性狀較穩(wěn)定等特點，已成為深受歡迎的鱘養(yǎng)殖品種。但是隨著中國鱘工廠化、高密度化養(yǎng)殖，各種疾病頻頻發(fā)生，卵霉病、敗血病、腫嘴病、錐蟲病、小瓜蟲?。ㄓ址Q白點病）、氣泡病和腹水癥等疾病的發(fā)生嚴(yán)重影響了鱘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

腹水癥是以腹水為主要臨床特征的一大類魚類疾病的總稱。可在包括黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[3]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[4]和鱘（Acipensers）[5]等在內(nèi)的多種水生動物上出現(xiàn)。該病多發(fā)生在高溫季節(jié)，可引起鱘大批量死亡。病魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為獨游、浮游、無力、停食、腹部膨脹；解剖病魚可見腹腔內(nèi)積有大量淡黃色或清亮透明的腹水。多種因素均可引起魚類腹水癥，包括細(xì)菌性因素，如嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）[6]、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）[7]；病毒性因素，如呼腸弧病毒（CCV）[8]、Sorimachi[9]；寄生蟲性因素，如隱鞭蟲（Cryptobia）[10]、艾美球蟲（Eimeria）[9]；營養(yǎng)性因素，如維生素E缺乏[11]；其他因素，如土霉素不合理長期使用，嚴(yán)重時可引起腹水[12]等。2015年四川某鱘養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的雜交鱘（施氏鱘♂×西伯利亞鱘♀）出現(xiàn)腹水的癥狀。該養(yǎng)殖場共有雜交鱘4萬余尾，患病雜交鱘體長10～15 cm，送樣時已有半月的發(fā)病期，開始時每日死亡20～30尾，至送樣時已達(dá)每日200尾左右，每天死亡率約為1.5%。發(fā)病后養(yǎng)殖戶采用1 g/kg的恩諾沙星混合1.5 g/kg的氟苯尼考拌料喂，未見明顯療效。病魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為獨游、游動無力、食欲降低或停食、張口呼吸等。本次研究采用臨床診斷、病原學(xué)、病理學(xué)對該病病因進(jìn)行分析，以期為類似疾病的防控提供參考借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

患病瀕死雜交鱘4尾（10～15 cm），來自四川某鱘養(yǎng)殖場，具有典型腹腔積水癥狀，用于剖檢觀察、病料采集和病原菌分離。

1.2 剖檢觀察

用MS-222將送檢魚麻醉后用于剖檢。首先檢查病魚體表完整性及其他體表癥狀，同時取少量鰓絲、體表黏液于載玻片上,壓片后顯微鏡下觀察有無寄生蟲。之后打開口咽腔、圍心腔、腹腔,依次觀察各體腔黏膜情況及各內(nèi)臟器官大體病理表現(xiàn)。最后取腸道內(nèi)容物壓片，觀察有無寄生蟲感染。

1.3 細(xì)菌學(xué)檢查

利用75%的乙醇體表消毒后，在無菌條件下分別從送檢魚的肝臟、脾臟、腎臟中用鉑金環(huán)接種細(xì)菌至BHI瓊脂培養(yǎng)基。分別于15℃和25℃下恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察1周，確定細(xì)菌的生長情況。

1.4 病毒學(xué)檢測

選取病變明顯的脾臟和肝臟組織，各取一小塊進(jìn)行混合勻漿，濾菌后加入含青、鏈霉素的Hanks液，12000r/min，離心5min后取上清液作為接種物接種胖頭鯉肌肉細(xì)胞系（FHM），25℃培養(yǎng)7后觀察細(xì)胞病變。

1.5 病理學(xué)檢查

分別采取患病魚的鰓、體側(cè)肌肉、心、肝、腎、脾、腦、胃、腸道、鰾、眼睛等組織，用10%的中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片（5 μm），H·E 染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察病理損傷，并照相記錄。對H·E染色下病變明顯的組織，用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病史及臨床癥狀

患病雜交鱘為池塘養(yǎng)殖模式下人工養(yǎng)殖的商品魚，體長10～15 cm。病魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為病魚攝食減少或者停食，魚體消瘦，游動緩慢、無力，常獨自弋游在水面或垂直懸浮于水面，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，呼吸困難，有的明顯可見腹部膨脹，積有腹水，側(cè)翻或腹部上翻，張口呼吸。發(fā)病水溫為25℃。發(fā)病后曾投喂恩諾沙星、氟苯尼考，未見明顯療效。

2.2 尸檢及病理學(xué)觀察

圖1 患病雜交鱘腹腔積水及實質(zhì)器官大體病變Figure 1 Ascites and gross pathology of diseased hybrid sturgeon

患病雜交鱘主要表現(xiàn)為腹部膨脹。剖解后在腹部發(fā)現(xiàn)大量清亮腹水（見圖1A）；脾臟蒼白，表面可見大小不一出血斑；肝臟發(fā)白（見圖1B），有直徑2～3 mm的出血點。消化道無食物，其他臟器眼觀病變不明顯。鰓絲、黏液及腸道內(nèi)容物壓片中未見明顯寄生蟲。

2.3 細(xì)菌學(xué)檢測

在無菌條件下利用接種環(huán)從病魚的脾臟、肝臟、腎臟中接種細(xì)菌至BHI培養(yǎng)基，15℃和25℃恒溫培養(yǎng)1 w后，未見明顯細(xì)菌生長。

2.4 病毒學(xué)檢測

組織勻漿上清液，過濾除菌后接種到FHM細(xì)胞系，25℃培養(yǎng)7 d后，未觀察到細(xì)胞病變。

2.5 組織病理學(xué)檢查

經(jīng)石蠟切片，H·E染色后觀察發(fā)現(xiàn)，該病靶器官主要出現(xiàn)在脾臟、肝臟、頭腎和體腎。此外，還可見輕微的心肌炎。肌肉、腦、眼睛、鰾等未見明顯病變。

脾臟主要表現(xiàn)為大面積充血，出現(xiàn)多灶性壞死（見圖2A），壞死灶內(nèi)細(xì)胞破裂，細(xì)胞核裂解、胞質(zhì)融合，且有許多炎性細(xì)胞分布，形成許多無結(jié)構(gòu)區(qū)域（見圖2B）。油鏡下可見細(xì)胞中有成簇狀生長的短桿狀細(xì)菌（見圖2C）。

肝臟主要病變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)紊亂，肝索消失，低倍鏡下可見許多區(qū)域彌漫性出血，大量紅細(xì)胞散在分布（見圖2D）。高倍鏡下可見肝實質(zhì)細(xì)胞溶解、破裂，結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)大面積無結(jié)構(gòu)區(qū)域（見圖2E）。肝靜脈及血竇中蓄積了大量炎性細(xì)胞。油鏡下可見壞死灶細(xì)胞內(nèi)有大量呈簇狀分布的桿菌（見圖2F）。

頭腎及體腎主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)性腎炎。頭腎組織顏色不均，大面積區(qū)域褪色（見圖2J），褪色灶內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞（見圖2K）。此外，體腎造血組織壞死，細(xì)胞崩解、破碎，細(xì)胞核濃縮深染，壞死組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小囊及血竇擴張（見圖2I）。

腸表現(xiàn)為腸絨毛部分壞死脫落，黏膜下層水腫，腸上皮細(xì)胞壞死脫落，固有層裸露（見圖2G），毛細(xì)血管充血并可見炎性細(xì)胞浸潤（見圖2H）。漿膜層水腫增厚，伴有炎性浸潤，油鏡下固有層和黏膜下層可見少量細(xì)菌。此外，心臟表現(xiàn)為輕微心肌炎，心肌小部分區(qū)域存在炎性浸潤現(xiàn)象（見圖2L）

2.6 病因分析

經(jīng)尸檢發(fā)現(xiàn)，病變主要在腹腔實質(zhì)器官內(nèi)，以脾臟和肝臟的病變最為明顯。病魚鰓絲、黏液及腸道內(nèi)容物壓片中未見明顯寄生蟲，可排除寄生蟲致病因素；采集病變器官進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，未見細(xì)胞病變，可基本排除病毒性致病因素；對病魚的各組織器官病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，脾臟和肝臟損傷明顯，油鏡下可見脾臟、肝臟、腎臟和腸道有大量呈簇狀生長的短桿狀細(xì)菌。從細(xì)菌學(xué)角度來看，雖然BHI培養(yǎng)基并沒有分離出病原性細(xì)菌，但組織切片的觀察中，病灶中均發(fā)現(xiàn)大量待確定具體種類的桿狀細(xì)菌。故綜上檢測結(jié)果，判定此次雜交鱘腹水綜合征可能是由某種桿菌感染引起。

3 討論

腹水，即腹腔內(nèi)蓄積大量液體成分，它不是獨立的疾病，而是伴隨與諸多病因的一種病征。導(dǎo)致其發(fā)生的主要有以下幾種病因：①心源性腹水：出現(xiàn)于能造成充血性心力衰竭的各種疾病，使靜脈系統(tǒng)淤血，體腔積液；②稀血性腹水：出現(xiàn)于能造成血液稀薄和膠體滲透壓明顯降低的疾病，如慢性貧血或低蛋白血癥等，使蛋白丟失過多和體液存留而致發(fā)本??；③瘀血性腹水：出現(xiàn)于能造成門靜脈系統(tǒng)淤血的各種疾病，如肝硬化、肝壞死等，因靜脈壓升高血行受阻，毛細(xì)血管內(nèi)液體滲出而發(fā)生腹水[13]。此次實驗中病魚有明顯的肝臟病變、脾臟病變，輕微的心臟病變，因此肝臟出血壞死導(dǎo)致門脈系統(tǒng)高壓，血液回心受阻引起的腹腔內(nèi)積液可能性較大。

對于養(yǎng)殖魚類腹水癥的發(fā)生原因，國內(nèi)外學(xué)者都進(jìn)行了廣泛研究。目前發(fā)現(xiàn)的致病因素包括細(xì)菌性因素，如氣單胞菌類感染[14]；病毒性因素，如魚腹水病毒（YAV）感染[15]；寄生蟲因素，如吸蟲綱的某些寄生蟲感染[16-17]。此外，營養(yǎng)不良，微量元素缺乏等也可以繼發(fā)腹水癥狀。此次實驗中，運用病原菌分離培養(yǎng)技術(shù)雖然未能分離到目標(biāo)菌株，但在組織病理學(xué)觀察中，在肝臟、脾臟、腎臟、腸道等多個組織器官均發(fā)現(xiàn)大量細(xì)菌，可基本推測本病是一種細(xì)菌性疾病。至于未能成功分離到細(xì)菌可能原因有：其一，該細(xì)菌生長或?qū)I養(yǎng)要求高或需其他特殊條件，在常規(guī)培養(yǎng)基上無法生長；其二，該細(xì)菌寄生于器官細(xì)胞內(nèi)，不易分離培養(yǎng)，而本實驗亦未進(jìn)行組織搗碎研磨涂抹培養(yǎng)。

此次在雜交鱘病灶部位發(fā)現(xiàn)大量細(xì)長、棒桿狀、胞內(nèi)成簇狀生長的細(xì)菌。水產(chǎn)上呈簇狀的桿菌主要有柱狀黃桿菌[18]、溶藻弧菌[19]、和副溶血弧菌[20]等幾個種類。此次實驗中的致病菌具體是哪種細(xì)菌有待進(jìn)一步鑒定。目前，針對胞內(nèi)菌感染的藥物不多，可供選擇的有酰胺醇類，如氟苯尼考；四環(huán)素類，如多西環(huán)素等。

圖2 患病雜交鱘組織病理學(xué)表現(xiàn).Figure 2 Histopathological manifestations of diseased hybrid sturgeon

魚類腹水癥在許多疾病上均有表現(xiàn)，因此僅根據(jù)臨床癥狀難以確診，需借助其他特殊診斷法。病理學(xué)診斷方法與其他方法相比，具有切片制作簡單，所需器材常見，耗時短的特點。通過顯微鏡觀察，不僅可以直觀觀察到組織病變情況，快速確定被攻擊的靶器官，明確機體病變情況，而且可以直接觀察到細(xì)菌、寄生蟲、真菌等部分病原，明確疾病種類，防止操作失誤導(dǎo)致的誤診，彌補分離培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)易受多種條件影響的這一不足，為下一步確診和治療指明方向。

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