來夢(mèng)婕,陳玉峰,張 英,楚秉泉

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程研究中心,浙江杭州 310058)

傷口愈合是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子參與的復(fù)雜且耗能的過程[1]。營(yíng)養(yǎng)不良與飲食攝入不足可顯著延緩一般性手術(shù)及慢性傷口的恢復(fù)。傷口愈合時(shí),為了維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生局部或全身性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致基礎(chǔ)代謝率增高,能量消耗增加,機(jī)體易出現(xiàn)負(fù)氮平衡[2]。負(fù)氮平衡的持續(xù)加劇將直接導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)的大量流失。Kumar等[3]發(fā)現(xiàn)膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)重要組成成分,外敷可促進(jìn)傷口愈合,如Chikazu等[4]研究證明深海膠原蛋白凝膠敷料對(duì)糖尿病小鼠切除型傷口愈合非常有用,Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)口服鮭魚皮肽具有促進(jìn)創(chuàng)傷型大鼠傷口愈合的潛力。

加利福尼亞灣石首魚(Totoabamacdonaldi),又稱麥?zhǔn)贤蓄^石首魚、加州犬型黃花魚,屬硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科,其最大可長(zhǎng)至2 m重至100 kg,或者更甚,是該科最大型的海洋魚類,為墨西哥加利福尼亞灣的特有魚種[6]。其魚鰾與中國(guó)黃唇魚(Bahabaflavolabiata)的魚鰾形態(tài)相似且名貴[7],加灣石首魚也因此被稱為“墨西哥黃唇魚”。自上世紀(jì)60年代以來,因過度捕撈及棲息地生態(tài)變化,自然資源頻臨衰竭[6]。自然捕獲的墨西哥黃唇魚基本停留在“殺魚取鰾”的原始階段,由于其魚肉口感粗糙,經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高,常被直接丟回大海,造成水域污染和資源浪費(fèi)。近年來,隨著人工繁殖和增殖放流技術(shù)的突破,養(yǎng)殖墨西哥黃唇魚取鰾后魚體的綜合利用和高值轉(zhuǎn)化受到關(guān)注。

本研究以墨西哥黃唇魚肉為原料,利用復(fù)合酶法首次制得口服易吸收的寡肽,運(yùn)用小鼠皮膚創(chuàng)傷模型,探索其對(duì)傷口愈合的促進(jìn)作用，以期開發(fā)一種能夠顯著促進(jìn)傷口愈合的高品質(zhì)口服膠原肽功能食材,為取鰾后墨西哥黃唇魚肉的高值轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨西哥黃唇魚凍品 浙江黃唇漁生物科技有限公司;堿性蛋白酶(10萬IU)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(1.4萬IU) Novozymes公司;L-甲硫氨酸(純度>99%)、核糖核酸酶A(純度>99%) Sigma公司;成骨生長(zhǎng)肽(純度>97%)、胸腺五肽(純度>90%) 杭州中肽生物有限公司;雄性ICR小鼠SPF級(jí),體重(25±2) g,合格證號(hào)SCXK(滬)2012-0005 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;羥脯氨酸試劑盒 南京建成科技有限公司;VEGF多克隆抗體、兔抗bFGF和HRP-山羊抗兔二抗 Servicebio公司。

JYL-C022E型多功能料理機(jī) 九陽股份有限公司;HHS21-Ni6型電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;LGJ-200F型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;208型凝膠滲透色譜儀 WATERS公司;RM2016型病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司;722E型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;NIKON ECLIPSE TI-SR型倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 墨西哥黃唇魚肉膠原肽(TMCP)的制備 冷凍的魚體解凍后用流水洗凈,絞碎制成魚糜,密封袋分裝,冰凍備用。根據(jù)王巖等[8]利用雙酶法制備鰱魚水解肽的工藝參數(shù)及前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,制備步驟如下:將魚糜分散于蒸餾水中,料∶水比為 1∶2 (g/mL),加熱至50 ℃后,調(diào)節(jié)pH為7.0,加入1.0%的復(fù)合酶(堿性蛋白酶∶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶=1∶2),酶解時(shí)間為4 h,待反應(yīng)結(jié)束后,至沸水浴中加熱20 min使酶失活,然后將酶解液在10000 r/min下離心10 min,取上清液,冷凍干燥,制得TMCP 凍干粉。

1.2.2 TMCP的氨基酸組成分析 根據(jù) GB/T 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》[9]方法進(jìn)行TMCP的前處理,氨基酸分析儀測(cè)定其氨基酸種類及含量。

1.2.3 TMCP的分子量分布測(cè)定 采用Waters凝膠色譜系統(tǒng)測(cè)定TMCP的分子量分布范圍,色譜條件為:凝膠柱:TOSOH TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×30 cm),波長(zhǎng):220 nm;流動(dòng)相:乙腈-水-三氟乙酸(三者體積比10∶90∶0.1);進(jìn)樣量:40 μL;柱溫:40 ℃;流速:0.6 mL/min[10]。

1.2.4 小鼠皮膚創(chuàng)傷模型的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉后,剃去背毛,經(jīng)常規(guī)皮膚消毒,在脊柱中部左右兩側(cè)相同位置蓋上圓形印章(直徑為8.0 mm),無菌條件下用手術(shù)剪沿印記邊緣剪去皮膚,制造出圓形全層皮膚傷口。造模后進(jìn)行單籠飼養(yǎng),并將造模當(dāng)天記為第0 d。

1.2.5 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn) 取40只體重為(25±2) g的小鼠,隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為空白對(duì)照組、膠原肽低劑量組(TMCP_L,0.66 g/kg·bw)、中劑量組(TMCP_M,1.33 g/kg·bw)、高劑量組(TMCP_H,2.0 g/kg·bw)。空白對(duì)照組給予等體積溶劑(去離子水)灌胃。術(shù)后次日起,每日灌胃。分別于造模后的第7 d和第14 d分批處死動(dòng)物(每組每批各5只)。每次處死后的小鼠分別切取其左右兩側(cè)傷口邊緣3.0 mm的全層皮膚組織,右側(cè)固定于4%多聚甲醛24 h以上,制成石蠟切片,用于HE染色分析、Masson染色分析和免疫組織化學(xué)染色分析;左側(cè)用于測(cè)定羥脯氨酸含量。造模及取樣部位見圖1。

圖1 小鼠皮膚創(chuàng)傷模型示意圖Fig.1 Sketch map of the wound healing in mice

1.2.6 傷口愈合率測(cè)定 每日觀察傷口變化情況,每隔2 d給小鼠傷口拍照,采用毫米方格坐標(biāo)紙記數(shù)法計(jì)算小鼠的傷口面積,觀察時(shí)間為0～14 d。傷口完全愈合即創(chuàng)面完全上皮化的標(biāo)準(zhǔn):愈合面積大于原始傷口面積的95%(即傷口面積小于原始傷口面積的5%)[11]。

傷口愈合率(%)=(初始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100

1.2.7 傷口組織病理學(xué)分析(HE染色) 將1.2.5中制得的組織切片用甲苯-無水酒精脫去石蠟,然后經(jīng)過100%、70%、50%、20%、0%的乙醇洗滌,切片入Harris蘇木素染3～8 min,自來水洗,1%的鹽酸乙醇(70%乙醇做溶劑)分化數(shù)秒,自來水沖洗,0.6%氨水返藍(lán),流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。脫水封片后在顯微鏡下觀察傷口愈合過程中的病理變化。

1.2.8 膠原含量分析(Masson染色) 將1.2.5中制得的組織切片同1.2.7步驟做脫蠟處理。用weigert鐵蘇木素染料(weigert鐵蘇木素A、B液等比例混和)染5～10 min,流水稍洗。1%鹽酸酒精分化,流水沖洗數(shù)分鐘。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min,流水稍沖洗。磷鉬酸溶液處理約5 min,不用水洗,直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染15 min。1%冰醋酸處理30 s,95%酒精脫水多次。無水酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。在顯微鏡下觀察傷口愈合過程中膠原沉積的變化,膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維、纖維素呈紫紅色。每個(gè)樣本隨機(jī)找5個(gè)不同的視野拍攝照片,使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算膠原含量。

1.2.9 傷口組織的羥脯氨酸含量測(cè)定 作為膠原蛋白特異性的基本成分,羥脯氨酸的含量可以作為傷口組織中膠原含量的重要指標(biāo)[12]。依據(jù)羥脯氨酸試劑盒(堿水解法)操作方法,組織水解后調(diào)節(jié)pH為6.5,加入20 mg活性炭,混勻,在3500 r/min下離心10 min,取上清液1 mL,與檢測(cè)液按要求混勻,3500 r/min下離心10 min,取上清液,550 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算羥脯氨酸含量。

羥脯氨酸含量(μg/mg濕重)=(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)

1.2.10 免疫組織化學(xué)染色法分析 1.2.5中制得的組織切片經(jīng)抗原修復(fù)和血清封閉后,在切片上滴加VEGF多克隆抗體(稀釋度1∶200)和兔抗bFGF(稀釋度1∶300),4 ℃過夜,次日滴加山羊抗兔二抗(稀釋度1∶200)及抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,陽性細(xì)胞呈棕黃色。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)400倍視野進(jìn)行拍照,拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野,保證每張照片的背景光一致[13]。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),分析得出每張照片陽性的積分光密度值(Integrated Optical Density,IOD)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 墨西哥黃唇魚膠原肽(TMCP)的氨基酸組成分析

從TMCP中檢測(cè)出22種氨基酸,包括8種必需氨基酸、2種半必需氨基酸、8種非必需氨基酸和4種特殊氨基酸,氨基酸組成較為全面。根據(jù)表1,TMCP中必需氨基酸占氨基酸總量的比值(WEAA/WTAA)為40.04%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(WEAA/WNEAA)為81.91%。根據(jù)FAO/WHO的理想模式,質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)其組成氨基酸的WEAA/WTAA為40%左右,WEAA/WNEAA在60%以上[14]。因此,TMCP的氨基酸組成符合FAO/WHO評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白源。

表1 TMCP的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acids composition and contents of TMCP

在TMCP的氨基酸測(cè)定中檢出了4種特殊氨基酸,且具有相當(dāng)高的含量(?；撬?.74%、γ-氨基丁酸1.03%、鳥氨酸0.37%、羥脯氨酸1.24%)。?；撬嵩谀X神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用;γ-氨基丁酸在臨床上主要用于降血壓及恢復(fù)腦細(xì)胞功能;鳥氨酸參與體內(nèi)氨態(tài)氮的排出和尿素形成;羥脯氨酸在許多蛋白質(zhì)中含量很低或沒有,但是膠原蛋白的主要組成部分,占了25%以上[7]:與區(qū)又君等[7]報(bào)道的野生黃唇魚鰾中的氨基酸組成相類似,推測(cè)其肌肉及其水解物也應(yīng)具有與魚鰾相似的保健功能和藥用價(jià)值。

2.2 TMCP的分子量分布

凝膠色譜系統(tǒng)分析結(jié)果見圖2,經(jīng)堿性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解得到的TMCP峰形良好,分散度小,分子量均一,測(cè)定得其平均分子量(Mw)為837 Da,是約由5～8個(gè)氨基酸組成的寡肽。張寧等[15]通過胃炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)膠原肽平均分子量1 kDa的吸收率>3 kDa的吸收率>20 kDa的吸收率,推測(cè)平均分子量837 Da寡肽受胃消化過程影響小,可通過運(yùn)載體直接進(jìn)入血液,吸收速度快。本文采用獨(dú)特的酶解技術(shù)制備得到的TMCP寡肽分子量小于1 kDa,極易被人體吸收。

圖2 TMCP分子量測(cè)定的凝膠色譜圖Fig.2 Results from gel permeation chromatography measurement

2.3 TMCP對(duì)小鼠傷口愈合率的影響

由圖3可知,隨著造模后愈合時(shí)間的增加,各組小鼠的創(chuàng)面面積均逐漸減小,傷口愈合率隨之升高。造模后第4 d起,TMCP處理組的傷口愈合率均高于空白對(duì)照組,并在造模后的第2、4、6 d,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系,且低(0.66 g/kg)劑量從第4 d起即已表現(xiàn)出極好的促進(jìn)愈合作用;在造模后第2周,TMCP處理組間的傷口愈合率無顯著差異,在造模后第14 d均完全愈合(傷口愈合率達(dá)到95%),與空白對(duì)照組存在極顯著差異(p<0.01)。造模后第6 d,TMCP處理組的傷口愈合率極顯著高于空白對(duì)照組(p<0.01)。說明TMCP可以加速傷口愈合,尤其是在愈合前期表現(xiàn)出極好的促進(jìn)效果。

圖3 TMCP對(duì)小鼠傷口愈合的影響Fig.3 The effect of TMCP on the wound healing of mice

2.4 TMCP對(duì)小鼠皮膚傷口組織病理變化的影響

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,有多種細(xì)胞和組織成分參與,包括成纖維細(xì)胞增殖、膠原分泌、新生血管生成、表皮細(xì)胞增殖和傷口的上皮化等[1]。TMCP對(duì)小鼠傷口組織病理變化的影響見圖4。造模后第7 d,空白對(duì)照組小鼠皮膚傷口組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(炎癥細(xì)胞在反應(yīng)灶聚集,多為核圓形,著色深),少量新生血管(多為卵圓形,多在創(chuàng)面處),表皮組織尚未形成;TMCP_L組傷口組織中有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),新生血管豐富,少量成纖維細(xì)胞(多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu))[16]開始分泌膠原纖維;TMCP_M組傷口組織中有少量炎癥細(xì)胞,少量成纖維細(xì)胞,大量膠原纖維生成,表皮組織逐漸形成;TMCP_H組傷口組織中有少量炎癥細(xì)胞,較多成纖維細(xì)胞,大量膠原纖維生成,并有毛囊等皮膚附屬器產(chǎn)生,表皮組織逐漸形成。

圖4 造模后第7 d小鼠皮膚傷口組織病理切片觀察(HE,×100)Fig.4 Representative micrographs of H&E stained wound tissues in mice at day 7(HE,×100)注:a為空白對(duì)照組;b為TMCP_L組;c為TMCP_M; d為TMCP_H組;I為炎癥細(xì)胞;V為血管; F為成纖維細(xì)胞;E為表皮。

如圖5,造模后第14 d,空白對(duì)照組仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肉芽組織(初始階段的纖維結(jié)締組織)[16]新鮮,新生較多膠原纖維;TMCP_L組有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),成纖維細(xì)胞生成大量膠原纖維,表皮組織基本形成;其余兩組基本無炎性滲出物,大量成纖維細(xì)胞和膠原纖維出現(xiàn),且膠原纖維排列有序,肉芽組織較對(duì)照組成熟,創(chuàng)口邊緣均有較厚的新生表皮。

圖5 造模后第14 d小鼠皮膚傷口組織病理切片觀察(HE,100×)Fig.5 Representative micrographs of H&E stained wound tissues in mice at day 14(HE,×100)注:A為空白對(duì)照組;B為TMCP_L組;C為TMCP_M組; D為TMCP_H組;I為炎癥細(xì)胞; V為血管;F為成纖維細(xì)胞;E為表皮。

組織病理學(xué)分析結(jié)果表明,中、高劑量組的TMCP能夠趨化誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞,刺激成纖維細(xì)胞增殖和分化并伴隨新的毛細(xì)血管和表皮組織的生長(zhǎng),表明TMCP可以促進(jìn)上皮組織重塑過程。

2.5 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中膠原含量的影響

TMCP對(duì)小鼠皮膚傷口組織中膠原含量的影響如表2所示。隨著造模后天數(shù)的增加,各組中膠原纖維均逐漸增多。造模后第7、14 d,TMCP處理組膠原含量與空白對(duì)照組相比均有極顯著差異(p<0.01);且TMCP三個(gè)劑量組間也存在顯著差異(p<0.05),膠原含量呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。傷口愈合過程中,纖維細(xì)胞通過沉積和降解膠原蛋白分子,使膠原纖維有序排列重構(gòu)膠原化的真皮結(jié)構(gòu)[17]。曾有文獻(xiàn)[18]報(bào)道,在體外NIH/3T3成纖維細(xì)胞模型中,刺參多肽能顯著提高I型膠原的分泌量。

表2 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中膠原含量的影響Table 2 The effect of TMCP on the collagen content in wound tissue

2.6 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中羥脯氨酸含量的影響

由于羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%,是膠原蛋白特征性成份之一[19],因此可以通過檢測(cè)羥脯氨酸的含量進(jìn)一步反映膠原蛋白的量。TMCP對(duì)小鼠傷口愈合過程中羥脯氨酸含量的影響見表3。可知,隨著愈合天數(shù)的增加,傷口組織中的羥脯氨酸含量也隨之增加。第7、14 d時(shí),TMCP_M組與TMCP_H組傷口組織中的羥脯氨酸含量差異不顯著(p>0.05),但均極顯著高于空白對(duì)照組(p<0.01)。第14 d時(shí),TMCP_L組與TMCP_M組傷口組織中的羥脯氨酸含量差異不顯著(p>0.05),但均高于空白對(duì)照組。這與半定量分析膠原含量的結(jié)果較一致。

表3 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中羥脯氨酸含量的影響Table 3 The effect of TMCP on the Hydroxyproline content in wound tissue

2.7 免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果

2.7.1 TMCP對(duì)小鼠皮膚傷口組織中VEGF表達(dá)的影響 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)[20]是目前研究發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)大、作用范圍最廣的促血管生成因子,能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移,從而促進(jìn)新生血管形成[21]。TMCP對(duì)小鼠傷口組織中VEGF表達(dá)的影響見表4、圖6,隨著造模后天數(shù)的增加,傷口組織中的VEGF表達(dá)量呈增加趨勢(shì)。造模后第7、14 d,TMCP處理組中VEGF表達(dá)均極顯著高于對(duì)照組(p<0.01),且在愈合前期,TMCP處理組的VEGF表達(dá)量約兩倍于空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)表明,TMCP在傷口愈合前期對(duì)VEGF的表達(dá)具有極其顯著的促進(jìn)作用,這與王毅等[22]、Lee等[23]對(duì)創(chuàng)傷愈合中VEGF表達(dá)的生物動(dòng)力學(xué)變化的研究結(jié)果一致。

表4 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中VEGF表達(dá)的影響Table 4 The effect of TMCP on the expression of VEGF in wound tissue

圖6 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中VEGF表達(dá)的影響(400×)Fig.6 The effect of TMCP on the expression of VEGF in wound tissue(400×)注:圖中箭頭所指的棕黃色顆粒為陽性信號(hào);圖7同。

2.7.2 TMCP對(duì)小鼠皮膚傷口組織中bFGF表達(dá)的影響 傷口創(chuàng)面中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的高表達(dá),有助于傷口愈合過程中肉芽組織的增生[24]。TMCP對(duì)小鼠傷口組織中bFGF表達(dá)的影響見表5、圖7,隨著造模后天數(shù)的增加,傷口組織中的bFGF表達(dá)量呈增加趨勢(shì)。造模后第7 d,TMCP_L組中bFGF表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05),中、高劑量組極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)。造模第14 d,對(duì)照組及TMCP_L組的bFGF表達(dá)量均上升,而中、高劑量組的表達(dá)量小幅上漲。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,TMCP在整個(gè)傷口愈合期對(duì)bFGF的表達(dá)均有促進(jìn)作用,Sadanori等[25]發(fā)現(xiàn)在早期損傷階段bFGF可通過激活ERK通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖與DNA合成,這與TMCP中、高劑量組成纖維細(xì)胞在愈合前期大量生成的結(jié)果相近。

表5 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中bFGF表達(dá)的影響Table 5 The effect of TMCP on the expression of bFGF in wound tissue

圖7 TMCP對(duì)小鼠傷口組織中bFGF表達(dá)的影響(400×)Fig.7 The effect of TMCP on the expression of bFGF in wound tissue(400×)

因此推測(cè),TMCP通過提高bFGF和VEGF的表達(dá)從而加快細(xì)胞增殖和血管生成,是其促進(jìn)小鼠傷口愈合的機(jī)制之一。

3 結(jié)論與討論

本研究經(jīng)復(fù)合酶解處理墨西哥黃唇魚肉,得到數(shù)均分子量為837 Da的寡肽(TMCP),氨基酸組成分析為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白源,其中有相當(dāng)高含量的牛磺酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸和羥脯氨酸。利用小鼠傷口愈合模型,結(jié)合傷口愈合率、病理組織切片觀察、膠原及羥脯氨酸含量測(cè)定和bFGF、VEGF生長(zhǎng)因子表達(dá)等指標(biāo),TMCP在所試劑量(0.66～2.0 g/kg)范圍內(nèi)都表現(xiàn)出良好的促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈合的作用,并在造模后的第一周內(nèi)表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系,初步探索表明墨西哥黃唇魚膠原肽(TMCP)對(duì)促進(jìn)傷口恢復(fù)有極大潛力。從全過程綜合指標(biāo)分析來看,中劑量與高劑量的效果相當(dāng)。后續(xù)新產(chǎn)品研發(fā)中的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建議參照TMCP中劑量水平(1.33 g/kg)來優(yōu)化產(chǎn)品組方及進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)和作用機(jī)制研究。

近年如何促進(jìn)傷口愈合速度并提高愈合質(zhì)量一直是研究的熱點(diǎn)。目前,相當(dāng)一部分難愈合慢性創(chuàng)傷或潰瘍多繼發(fā)于糖尿病和老年病等,這可能與患者皮膚的特殊微環(huán)境和體內(nèi)免疫應(yīng)答功能障礙有關(guān)[26]。糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境更會(huì)不斷促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,約有25%的糖尿病患者終生伴有糖尿病足部潰瘍,其中,20%的患者由于不當(dāng)?shù)闹委熁蜃o(hù)理導(dǎo)致嚴(yán)重潰爛感染而被迫截肢[27]。TMCP的氨基酸組成含量豐富,特別是其含有4種極具藥用價(jià)值的特種氨基酸,可期望用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及改善體內(nèi)微環(huán)境。因此,TMCP對(duì)慢性難愈創(chuàng)面的輔助治療作用有待進(jìn)一步研究。此外,由于口服營(yíng)養(yǎng)品需要消化吸收時(shí)間,為了縮短傷口出血和凝血時(shí)間,臨床上需要與敷料配合使用,這也為墨西哥黃唇魚加工副產(chǎn)物魚鱗、魚皮等開發(fā)提供了思路。隨著對(duì)墨西哥黃唇魚研究的不斷深入,其在醫(yī)藥及保健領(lǐng)域的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

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