周?；?姜愛麗,姬亞茹,胡文忠,陳 晨,王馨悅

(大連民族大學生命科學學院,生物技術與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連 116600)

藍莓又名越橘,為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium.spp)多年生落葉或常綠灌木,是一種極耐寒的野生植物。其果實中富含維生素C(VC)、花色苷、多酚、黃酮等物質發(fā)揮抗氧化作用,具有抗癌和保護心血管等保健功能[1-4]。近年來,藍莓產業(yè)得到快速發(fā)展,目前有30多個國家栽培藍莓,栽培總面積約12萬hm2,但是產量僅能滿足需求量的40%～50%,這極大地限制了藍莓果實的鮮銷期和市場供應[5-6]?；颐共∈撬{莓果上發(fā)生的對產量影響較大的病害,各藍莓產區(qū)均有發(fā)生,其病原菌為灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)[7]。因此,防治藍莓灰霉病對提高藍莓產量具有重要意義。

納他霉素又名游霉素、匹(馬)霉素,屬多烯大環(huán)內酯類物質[8]。研究表明,納他霉素能有效抑制或殺死霉菌、酵母菌、絲狀真菌。與化學合成的抑菌劑相比,納他霉素還具有不易被人體吸收、無任何潛在過敏性、安全高效等特點,符合未來食品防腐劑的發(fā)展要求[9-13]。VC是一種天然的抗氧化劑和營養(yǎng)強化劑,具有清除活性氧、抑制食品成分氧化、還原某些氧化產物、對螯合劑起增效作用等作用[14]。目前納他霉素在國內市場上的諸多領域都有涉及,但使用納他霉素處理采后藍莓鮮果的報道甚少,納他霉素與其它防腐劑復配方面的研究更少。鑒于此,本文以納他霉素和與VC復配后的抑菌劑作為保鮮劑,研究納他霉素在藍莓保鮮中的作用,以期為藍莓保鮮提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.) 分離于自然發(fā)病的藍莓果實,并經PCR鑒定檢測[15]。將該病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上,在28 ℃下培養(yǎng)7 d后,用含有0.5 mL/L Tween60無菌水制成濃度為5×106CFU/mL的孢子懸浮液[16]。藍莓果實 品種為“布里吉塔”，選取成熟度、顏色、果個均勻一致,無病害和機械傷的果實進行實驗，采自大連藍風農業(yè)科技有限公司；納他霉素、PDA培養(yǎng)基 天津科密歐化學試劑有限公司。

PL203型梅特勒-托利多電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋公司;DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司;VS-1300超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最低抑菌濃度實驗 分別配制0.1、0.5、1 mg/L的納他霉素溶液并另將上述濃度溶液分別與20 mg/L VC復配(1∶1)。參照李東等[16]采用固體培養(yǎng)基(PDA)稀釋法確定單獨使用20 mg/L VC、納他霉素及納他霉素與20 mg/L VC復配的溶液在離體時的最低抑菌濃度。將定量的灰葡萄孢菌接種于上述培養(yǎng)基中,25 ℃恒溫培養(yǎng),觀測其生長情況。

1.2.2 活體接種實驗 取新鮮、外觀整齊、無病蟲害的藍莓用75%(v/v)的酒精消毒,晾干后,用滅菌鐵釘(直徑3 mm)在藍莓果實腰部均勻刺一3 mm深的傷口,1.5 h后分別用無菌水(對照),20 mg/L VC,1、10、20、30 mg/L濃度的納他霉素及其與20 mg/L VC復配溶液各1L浸泡果實,10 min后取出,靜置4 h以晾干,再在傷口處接種5×106CFU/mL的灰霉病菌孢子懸浮液5μL。每次處理30個果實。接種后,用經紫外線殺菌的塑料盒,外套薄膜,于28 ℃下培養(yǎng),濕度保持在95%左右。

1.2.3 發(fā)病率及病斑直徑的測定 分別于0、2、4、6 d后參照李志文等[17]的方法記錄果實的發(fā)病率,參照范青等的方法記錄病斑直徑[18],每次觀察10個果實,實驗重復三次,公式如下:

發(fā)病率(%)=發(fā)病果實質量/總質量×100

1.2.4 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法[19]測定。

1.2.5 抗病性相關酶的活性測定 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活性的測定參照姜愛麗等[14]的方法,分別以1 min內每克果實在398、460 nm下吸光度增加1為1個酶活力單位,結果以U·g-1表示,重復三次。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性的測定參照孟憲軍等[20]的方法,以1 min內每克果實在290 nm下吸光度增加1為1個酶活力單位,結果以U·g-1表示,重復三次。

1.3 數(shù)據處理與統(tǒng)計

所有實驗平行三次,實驗結果用平均值±標準偏差表示,用SPSS軟件進行顯著性統(tǒng)計分析,采用Ducan法(也稱新復極差法)檢驗差異顯著性,各圖中同一測定時間,不同字母表示實驗組的結果之間差異顯著(p<0.05),采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 最低抑菌濃度實驗

由表1可得,單獨使用納他霉素時,濃度為1 mg/L可以完全抑制灰霉病菌的生長;而當納他霉素與20 mg/L VC復配溶液作為抑菌劑時,0.5 mg/L的納他霉素濃度即可完全抑制病菌生長;單獨使用20 mg/L VC對灰霉病菌無抑制效果。說明VC與納他霉素復配可有效降低納他霉素的使用量。

表1 納他霉素對灰葡萄孢菌的最小抑菌濃度Table 1 minimal inhibitory concentration of Botrytis cinerea on natamycin

2.2 不同處理對藍莓果實發(fā)病率、病斑直徑的影響

納他霉素在低濃度下就能有效抑制真菌生長,對幾乎所有種類的真菌都有很強的抑制性[21],它不僅能夠抑制真菌,還能防止真菌毒素的產生。不同處理的采后藍莓發(fā)病率隨著貯藏時間的延長,均呈顯著上升趨勢(p<0.05),見圖1。2 d時,處理間發(fā)病率出現(xiàn)顯著差異(p<0.05),4 d時,每種處理的發(fā)病率均大幅增加,但各復配溶液處理的藍莓果實發(fā)病率均顯著低于(p<0.05)單獨使用納他霉素處理組,以30 mg/L納他霉素復配處理的果實發(fā)病率最低,6 d時,幾乎所有實驗組全部發(fā)病。可見,納他霉素復配處理果實可有效地抑制果實的發(fā)病率,并且以30 mg/L納他霉素復配20 mg/L VC溶液處理效果最好。

圖1 不同處理對藍莓果實發(fā)病率的影響Fig.1 Effect of different treatments on the morbidity of blueberry fruits注:不同字母表示相同貯藏時間數(shù)據結果之間差異顯著(p<0.05)；圖2～圖6同。

隨灰葡萄孢菌的生長,病斑會逐漸擴大,所以病斑直徑越小,樣品對病菌抑制效果越好。各處理的病斑直徑均隨貯藏時間的延長不斷增大,見圖2。與對照相比,所有樣品組均可有效減緩病斑直徑擴大速度,各復配溶液均較對照與單獨使用納他霉素、VC處理的抑菌效果好,并且隨納他霉素濃度的上升,復配溶液的抑菌效果增強。2 d時,所有處理的病斑直徑均有明顯變化,復配溶液處理的病斑直徑顯著小于其它處理(p<0.05)。6 d時,30 mg/L納他霉素復配處理果實的病斑直徑僅為對照的50%。實驗結果說明:納他霉素復配處理可有效地抑制果實表面灰霉病菌的繁殖,以30 mg/L納他霉素復配處理效果最好。

圖2 不同處理對藍莓果實病斑直徑的影響Fig.2 Effect of different treatments on the lesion diameter of blueberry fruits

納他霉素通過與細胞膜里的膽固醇,特別是麥角固醇這樣的固醇類形成復雜的復合物,改變細胞滲透性,從而抑制病菌生長繁殖[22-23]。藍莓發(fā)生病害主要由真菌引起,因此通過對發(fā)病率和病斑直徑的記錄可以發(fā)現(xiàn),納他霉素通過有效抑制病菌的繁殖來延長藍莓的貯藏期。

2.3 不同處理對藍莓果實蛋白質含量的影響

蛋白質是果蔬中酶的重要組分,參與許多代謝的調控,是反映果實優(yōu)劣的重要指標,也是評價果蔬營養(yǎng)品質和口感的主要指標[24]。與對照相比,單獨VC處理于第2、6 d時的蛋白質含量(顯著升高),整個貯藏期間,除單獨1 mg/L納他霉素處理呈不斷下降趨勢外,其余單獨納他霉素處理和納他霉素復配處理的蛋白質含量均在0～2 d內不斷上升,2 d時達到峰值后下降。隨納他霉素濃度的提高,蛋白質含量的保持效果逐漸顯著,以30 mg/L納他霉素復配處理效果最為顯著(p<0.05)。實驗結果表明:單獨納他霉素霉素及納他霉素復配處理均能有效保持藍莓果實蛋白質含量,以30 mg/L納他霉素與20 mg/L VC復配溶液處理效果最明顯。

圖3 不同處理對藍莓果實蛋白質含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on protein content of blueberry fruits

2.4 不同處理對藍莓果實中與抗性相關的酶活性的影響

PPO、POD、PAL在植物抗病反應中發(fā)揮著重要作用,因此被認為是植物抗病性的生理指標[25-27]。

PPO 在木質素及其它酚類氧化物質合成過程中起重要作用,與植物抗病性密切相關,其作用機制可能是通過提高其活性來促進植株體內酚類物質和木質素的合成和累積,以殺死病菌或阻止病菌的進一步穿透、侵入及擴展[28]。整個貯藏期間,各處理的PPO活性均呈先上升后下降趨勢,見圖4。2 d時達到峰值,以30 mg/L納他霉素復配處理PPO活性最高(p<0.05);6 d時,30 mg/L納他霉素復配處理藍莓果實的PPO活性分別是對照的1.97倍,單獨30 mg/L納他霉素處理的1.07倍?？梢?納他霉素復配處理可有效提高并保持PPO活性。

圖4 不同處理對藍莓果實PPO活性的影響Fig.4 Effect of different treatments on PPO activity of blueberry fruits

POD是果蔬成熟和衰老的指標,它不但可清除內源活性氧自由基,還參與植物木質素和植保素的合成。木質素主要位于纖維素纖維之間,起抗壓作用,有研究證明細胞壁的高度木質化對病菌的侵染和擴展有一定的抑制作用[29]。貯藏期間,各處理的POD活性均呈上升趨勢。0～2 d時上升速度較快,2 d后上升速度趨于緩慢(圖5)。單獨VC處理對POD活性幾乎無影響,而單獨納他霉素和納他霉素復配處理顯著影響POD活性,并且隨納他霉素濃度增大,POD活性也顯著增加,6 d,以30 mg/L納他霉素復配處理的POD活性最高(p<0.05),且POD活性是對照的1.22倍(p<0.05)。由此可知,納他霉素復配處理可有效提高POD活性。

圖5 不同處理對藍莓果實POD活性的影響Fig.5 Effects of different treatments on POD activity of blueberry fruits

PAL是苯丙烷代謝的關鍵酶,與抗逆境脅迫等密切相關[30]。由圖6可知,各實驗組PAL活性變化趨勢相似,均為先升高,4 d時達到峰值后下降。單獨VC處理對PAL活性無明顯影響(p<0.05),納他霉素復配處理效果較單獨納他霉素處理效果明顯。4 d時,以30 mg/L納他霉素復配處理對PAL活性影響最顯著,且PAL活性是對照的1.38倍(p<0.05),由此說明,納他霉素復配處理可有效提高并保持PAL活性。

圖6 不同處理對藍莓果實PAL活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on PAL activity of blueberry fruits

3 結論

納他霉素對藍莓灰霉病病菌的最低抑菌濃度為1 mg/L,與20 mg/L VC復配后的納他霉素最低抑菌濃度為0.5 mg/L,而單獨的抗壞血酸處理對病菌幾乎沒有抑制作用,說明與20 mg/L VC復配可降低納他霉素的使用量。

納他霉素對藍莓灰霉病具有較好的抑制作用,通過對發(fā)病率、病斑直徑的觀察,對蛋白質含量、與抗病相關酶活性變化的測定發(fā)現(xiàn):納他霉素復配處理對病菌的抑制效果比單一的VC和納他霉素處理的抑制效果更明顯,并且隨納他霉素濃度的升高,無論是單一納他霉素處理還是復配溶液處理對藍莓灰霉病病菌的抑制作用均增強,復配溶液增強效果更加顯著。

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