王翰華,陳宏降,王 強(qiáng),倪夢茜,3,阮洪生,*

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,浙江寧波 315100; 2.寧波市中醫(yī)院,浙江寧波 315010; 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江杭州 310053)

浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)為百合科植物,其干燥鱗莖是道地藥材“浙八味”之首[1],有效成分是生物堿。前期研究表明,浙貝母花具有止咳化痰功效[2]。枇杷[Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.]為薔薇科植物,其葉和花可作藥用[3],枇杷花的有效成分是黃酮。寧海白枇杷是浙江省寧海縣引進(jìn)白沙枇杷,在獨(dú)特的地方小氣候環(huán)境中,優(yōu)育的新品種[4]。浙貝母和寧海白枇杷都是寧波市特色經(jīng)濟(jì)作物。在生長過程中,它們的花大部分被打頂或疏掉,造成很大的浪費(fèi)。中醫(yī)理論而言,浙貝母味苦,性寒,歸肺、心經(jīng),有清熱散結(jié),化痰止咳的功效,浙貝母花有止咳化痰功效[5];枇杷花味淡,微溫,歸肺經(jīng),有疏風(fēng)止咳,通鼻竅的功效[6],浙貝母花與枇杷花配伍可發(fā)揮協(xié)同功效。

隨著社會進(jìn)步,人民生活水平的提高及生活節(jié)奏的加快,使得亞健康人群不斷增加,人們對保健食品的需求越來越大,促使了保健飲料的高速發(fā)展同時(shí)也帶來了巨大的挑戰(zhàn)。保健飲料的發(fā)展已進(jìn)入加速發(fā)展階段,以中藥為原料的功能飲料市場潛力巨大[7]。但目前,以止咳為賣點(diǎn)的保健飲料仍然較為缺乏。

前期研究表明,浙貝母花-寧海白枇杷花(4∶1)配伍時(shí),能較好地協(xié)同發(fā)揮止咳化痰作用[8]。在此基礎(chǔ)上,本文以浙貝母花和寧海白枇杷花為原料,研制一款色香味俱佳的新型復(fù)合保健飲料,并考察其止咳功效,以填補(bǔ)市場空白,并為浙貝母和寧海白枇杷的相關(guān)藥用資源開發(fā)利用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

浙貝母花 浙貝母花采自寧波市海曙區(qū)龍觀鄉(xiāng),經(jīng)楊雄志教授鑒定為百合科浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的花;寧海白枇杷花 采自寧海縣一市鎮(zhèn),經(jīng)楊雄志教授鑒定,為薔薇科枇杷Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.的花;貝母素乙對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號110751-201110,含量以99.9%計(jì);蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號100080-201409,含量以92.6%計(jì);蜜煉川貝枇杷膏 廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司,批號160118;木糖醇、檸檬酸、蜂蜜和果膠等 市售；SPF(無特定病原體)級小鼠(體質(zhì)量20～25 g,雌雄各半)、豚鼠(雌雄兼用,體質(zhì)量190～210 g) 由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SYXK(浙)2012-0178。

400A型小型粉碎機(jī) 永康云達(dá)冷風(fēng)機(jī)廠;DZKW-D4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海之信儀器有限公司;DSX-280A型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;WH-2000超聲霧化器 廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司;TU-1818型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DR-M2型阿貝折光儀 ATAGO(愛拓)中國分公司;MP511 pH計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生產(chǎn)工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn) 預(yù)處理:將浙貝母花與寧海白枇杷花分別進(jìn)行除雜后粉碎。

提取:根據(jù)確定的浙貝母花與寧海白枇杷花提取工藝操作。

粗濾:布氏漏斗(單層濾紙)抽濾。

調(diào)配:在調(diào)配灌按配方比例(浙貝母花提取液160 g/L,寧海白枇杷花提取物40 g/L)將浙貝母花提取液、寧海白枇杷花提取液混合,再加入一定量的木糖醇、檸檬酸、蜂蜜和果膠,用攪拌器充分?jǐn)嚢璨⒓訜?0 min,過濾。

精濾:除去飲料中的細(xì)微顆粒及沉淀,使之澄清透明,再進(jìn)行2次過濾。

滅菌:將成品放于高壓滅菌鍋中,條件為90 ℃,30 min,然后冷卻至室溫。

1.2.3 浙貝母花提取工藝

1.2.3.1 浙貝母花水提液的制備 取浙貝母花,粉碎,過4號篩,精密稱取50 g,加一定量水,提取一定時(shí)間,重復(fù)一定次數(shù),合并提取液,過濾并濃縮至100 mL,得浙貝母花水提液,測定水提液中總生物堿量(Y1,%)及浸膏得率(Y2,%)。

1.2.3.2 提取工藝設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)，以加水量(相對于浙貝母花質(zhì)量)、提取時(shí)間及提取次數(shù)為考察因素，以總生物堿量、浸膏得率為指標(biāo)(總生物堿量和浸膏得率的加權(quán)系數(shù)各為0.5)，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。采用綜合加權(quán)評分法，以正交試驗(yàn)中總生物堿量和浸膏得率的最大值為100分，將各指標(biāo)成分的總量分別轉(zhuǎn)換為評分值，計(jì)算綜合評分，再以綜合評分計(jì)算正交試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行方差分析，優(yōu)選浙貝母花水提最佳工藝。

表1 浙貝母花正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments of Fritillaria thunbergii Miq. flower

1.2.2.3 總生物堿量和浸膏的測定 參考文獻(xiàn)[9]制備供試品,以貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)液為對照,413 nm處測定吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.008+0.043x,r=0.9996)計(jì)算總生物堿含量。照2015年版《中國藥典》浸出物測定法(通則2201)[10]項(xiàng)下方法測定,浸膏得率(%)=浸膏質(zhì)量/供試品質(zhì)量×100。

1.2.3 寧海白枇杷花提取工藝

1.2.3.1 寧海白枇杷花水提液的制備 取寧海白枇杷花,粉碎,過4號篩,精密稱取50 g,加一定量水,提取一定時(shí)間,重復(fù)一定次數(shù),合并提取液,過濾并濃縮至100 mL,得寧海白枇杷花水提液。測定提取液中總黃酮量(Y3，%)及浸膏得率(Y4，%)。

1.2.3.2 提取工藝設(shè)計(jì) 根據(jù)之前單因素預(yù)試驗(yàn)，以加水量、提取時(shí)間及提取次數(shù)為考察因素，以總黃酮量、浸膏得率為指標(biāo)(黃酮量和浸膏得率的加權(quán)系數(shù)各為0.5)，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表2。采用綜合加權(quán)評分法，以總黃酮量和浸膏得率的9次試驗(yàn)的最大值為100分，將各指標(biāo)成分的總量分別轉(zhuǎn)換為評分值，計(jì)算綜合評分值，再以綜合評分值計(jì)算正交試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行方差分析，優(yōu)選寧海白枇杷花水提最佳工藝。

表2 寧海白枇杷花正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments of Ninghaibai Loquat flower

1.2.3.3 總黃酮量和浸膏的測定 參考王翰華等[11]的方法配制供試品,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為對照,510 nm處測定吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=16.94x+0.004,r=0.9997)計(jì)算總黃酮量。照2015年版《中國藥典》浸出物測定法(通則2201)[10]測定,浸膏得率(%)=浸膏質(zhì)量/供試品質(zhì)量×100。

1.2.4 飲料配方的優(yōu)化 在之前單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以保健飲料的感官評分為評價(jià)指標(biāo)[12-15](表3),應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理數(shù)據(jù)[16],對飲料配方進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,按正交表L9(34),設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),因素與水平見表4。

表4 配方正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments of formula

1.2.5 質(zhì)量指標(biāo)檢測 由之前的紫外分光光度法測定飲料中總生物堿和總黃酮含量;阿貝折光儀測定飲料中可溶性固形物含量[17];pH計(jì)測定飲料的酸堿度;按照GB/T 4789.2-2010和GB/T 4789.3-2010分別對飲料中菌落總數(shù)、大腸菌群及致病菌進(jìn)行檢測[18]。同時(shí),在溫度40 ℃,相對濕度75%的條件下儲存3個(gè)月,考察穩(wěn)定性。

1.2.6 藥效學(xué)研究

1.2.6.1 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn) 對昆明種小鼠進(jìn)行預(yù)試[19],篩選出合格小鼠50只,雌雄各半。待小鼠穩(wěn)定3 d后,隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為空白對照組(生理鹽水)、保健飲料高、中、低劑量組(相當(dāng)于浙貝母花+寧海白枇杷花6.0,3.0,1.5 g/kg)和蜜煉川貝枇杷膏陽性對照組(4.0 g/kg),參考之前方法操作[2],記錄小鼠咳嗽潛伏時(shí)間和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。其中,高劑量(相當(dāng)于成人給藥量的40倍量)、中劑量(20倍量)、低劑量(10倍量)組,川貝枇杷膏陽性對照組(相當(dāng)于成人給藥量的20倍量)。

1.2.6.2 豚鼠枸櫞酸引咳實(shí)驗(yàn) 將豚鼠進(jìn)行預(yù)試[19],篩選出合格豚鼠50只,分組及給藥劑量同1.2.6.1。參考之前方法處理[2],記錄豚鼠咳嗽潛伏時(shí)間及5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,包括方差分析,顯著性差異分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙貝母花提取工藝的確定

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析見表5,影響提取效果的順序?yàn)樘崛r(shí)間>加水量>提取次數(shù),確定浙貝母花最佳提取條件為表A3B3C3,即加12倍量水,每次提取2 h,提取3次。此條件下,總生物堿量為0.328%,浸膏得率為4.83%,綜合評分98.66。方差分析顯示,3個(gè)因素對結(jié)果影響都不顯著,見表6。

表5 浙貝母花正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiments of Thunberg Fritillary flower

表6 浙貝母花方差分析Table 6 Analysis of variance of Thunberg Fritillary flower

2.2 寧海白枇杷花提取工藝的確定

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見表7,影響提取效果的順序?yàn)樘崛r(shí)間>提取次數(shù)>加水量,結(jié)合大生產(chǎn)及耗能,確定寧海白枇杷花最佳提取條件為表A2B2C1,即加9倍量水,每次提取1.5 h,提取1次。此條件下,總黃酮量為0.368%,浸膏得率為6.04%,綜合評分98.77。方差分析顯示,3個(gè)因素對結(jié)果影響都不顯著,見表8。

表7 寧海白枇杷花正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of orthogonal experiments of Ninghaibai Loquat flower

表8 寧海白枇杷花方差分析Table 8 Analysis of variance of Ninghaibai Loquat flower

2.3 飲料配方的確定

由方差分析(表10),4個(gè)因素對結(jié)果影響都不顯著。配方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9,方差分析見表10?？芍?對飲料品質(zhì)影響最大的因素是蜂蜜的添加量,其次是木糖醇和檸檬酸的添加量,而果膠的添加量對飲料品質(zhì)的影響相對較小;最優(yōu)結(jié)果為A2B1C3D3,即最佳配比條件是40 g/L的木糖醇、0.5 g/L的檸檬酸、35 g/L的蜂蜜和3 g/L的果膠。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),該配方的平均得分達(dá)到92分(n=5,RSD0.37%),確定為最佳配方。

表9 配方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 9 Results of orthogonal experiments of formula

表10 感官評分方差分析Table 10 Analysis of variance of sensory score

2.4 質(zhì)量檢測結(jié)果

隨機(jī)抽取5瓶成品進(jìn)行檢測,該飲料中總生物堿量為(0.12±0.010) mg/mL,總黃酮量(0.40±0.018) mg/mL,這為飲料發(fā)揮保健功能奠定了基礎(chǔ)?？扇苄怨绦挝锖?20 ℃,折光法)≥45%,pH為5.5,細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL,大腸桿菌≤0.02 MPN/mL,致病菌未檢出,均符合相關(guān)規(guī)定。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,產(chǎn)品在感官上變化不大,略有微量沉淀析出,pH為5.4,可溶性固形物的量保持穩(wěn)定,菌落群數(shù)和大腸桿菌未超標(biāo)。

2.5 藥效學(xué)結(jié)果

2.5.1 對小鼠氨水引咳影響 由表11可得,與空白對照組比較,保健飲料高、中劑量組和陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏,均能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠咳嗽次數(shù)(p<0.05);保健飲料高、中劑量組與陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏比較,未有顯著差異。表明,該保健飲料能明顯抑制由氨水引起的小鼠咳嗽。

表11 對小鼠氨水引咳的影響Table 11 The effects of ammonia water

2.5.2 對豚鼠枸櫞酸引咳影響 由表12可知，與空白對照組比較,保健飲料高、中劑量組和陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏,均能顯著延長豚鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠咳嗽次數(shù)(p<0.05),低劑量組雖有改善,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;保健飲料高、中劑量組與陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏比較,未有顯著差異。表明,該保健飲料對枸櫞酸引咳豚鼠有良好的抑制作用。

表12 對豚鼠枸櫞酸引咳的影響Table 12 The effects of citric acid causing cough in guinea

3 結(jié)論與討論

本研究確定浙貝母花-寧海白枇杷花保健飲料的最佳配方為:浙貝母花提取液160 g/L,寧海白枇杷花提取物40 g/L,木糖醇40 g/L、檸檬酸0.5 g/L、蜂蜜35 g/L、果膠3 g/L。檢測結(jié)果表明所研制的保健飲料工藝穩(wěn)定,各項(xiàng)指標(biāo)均符合保健食品相關(guān)規(guī)定。藥理實(shí)驗(yàn)表明,具有顯著的止咳作用。

口感是保健飲料品質(zhì)評價(jià)中最重要的指標(biāo),但為了改善口感,人們通常會降低飲料主成分,導(dǎo)致無法發(fā)揮良好的保健功能[20]。針對這一問題,本文為確保發(fā)揮飲料的最佳保健功效,在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定了浙貝母花提取液和寧海白枇杷花提取液的配比4∶1,通過調(diào)整木糖醇、檸檬酸、蜂蜜和果膠的配比來確定飲料的口感;在產(chǎn)品質(zhì)量檢測過程中,參考《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn),不僅對理化指標(biāo)及微生物檢測指標(biāo)進(jìn)行檢測,還對飲料中的總生物堿和總黃酮含量進(jìn)行了測定,從而確保飲料中有效成分的含量,進(jìn)一步保證飲料的保健功能。

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