徐樹(shù)來(lái),金慧榮,任紅波,王 麗,張 靜,陳井權(quán),溫 暖

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076; 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所,黑龍江哈爾濱 150086; 4. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150076; 5. 海倫野泰食品加工有限公司,黑龍江綏化 152000)

目前常見(jiàn)的提取綠原酸的方法有水提法[11]、醇提法[12]、微波提取法[13]、酶解-超聲組合法等。水提法和醇提法提取工藝雖然簡(jiǎn)單,但提取率較低,雜質(zhì)較多,不利于后期純化。微波提取法是一種新型節(jié)能的輔助提取方法,熱量可直接作用于分子的加熱過(guò)程,雖提取速率增加,但綠原酸為熱敏物質(zhì),極易造成綠原酸結(jié)構(gòu)的破壞,用于綠原酸的提取具有一定的局限性。本研究采用酶解超聲組合使用,具有條件溫和,操作便捷,提取率高,提取物結(jié)構(gòu)不被破壞等優(yōu)點(diǎn)。

本文選用酶解超聲聯(lián)用提取蒲公英莖葉中綠原酸,運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)篩選提取因素及水平范圍,最終確定纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間和超聲功率為主要影響因素,并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,從而研究酶解-超聲組合提取蒲公英綠原酸的最佳工藝條件,以期為蒲公英的精深加工及綜合利用提供有益的探究及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生干蒲公英莖葉 海倫野泰食品加工有限公司;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%,NO.17030620)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(純度98%,NO.20170106) 中國(guó)食品藥品鑒定研究院;無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉、無(wú)水亞硝酸鈉、羧甲基纖維素鈉、乙酸、乙酸鈉均為分析純、硅藻土 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;纖維素酶 固體,酶活:100 U/mg,和氏璧生物科技有限公司。

DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科科技有限公司;DEF-500型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;HC-7P11-5 型架盤(pán)藥物天平 上海精科科技有限公司;HH-4水浴鍋 金壇市天瑞儀器有限公司;FA2004B型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;KQ-500VDED雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-4A 離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;pH計(jì)測(cè)試儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;85-2恒溫磁力攪拌器 金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法 精確稱(chēng)取過(guò)80目篩的蒲公英干粉2.00 g,采用正己烷脫脂(熱回流法,條件為料液比1∶10,脫脂溫度50 ℃,脫脂時(shí)間0.5 h),脫脂樣品置于100 mL的燒杯中,加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液(通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定乙醇濃度為70%),添加纖維素酶,調(diào)節(jié)pH[14],調(diào)節(jié)溫度,酶解一定時(shí)間后,沸水浴5 min滅酶,然后進(jìn)行超聲處理,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約為提取液體積的1/3,向溶液中加入2 g硅藻土(吸附大分子蛋白質(zhì)和糖),置于磁力攪拌器上攪拌5 min,8000 r/min離心10 min,取清液,即得蒲公英綠原酸提取液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定因素固定水平:乙醇濃度70%、纖維素酶用量0.3%(占干料的百分比)、酶解時(shí)間1.0 h、pH4、酶解溫度50 ℃、超聲功率150 W、超聲時(shí)間1.5 h、料液比1∶20 (g/mL)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,酶解溫度、酶解pH、料液比對(duì)綠原酸提取率影響不大,固不作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的考察因素。分別考察各單因素對(duì)綠原酸得率的影響:纖維素酶用量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;酶解時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h;超聲功率50、100、150、200、250 W;超聲時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 選取纖維素酶添加量、纖維素酶解時(shí)間、超聲功率、超聲時(shí)間為主要影響因素,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定的水平值,以綠原酸得率為考察指標(biāo),進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,參閱文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[15],因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 纖維素酶活性的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸法[16],測(cè)定纖維素酶樣品活性,并測(cè)定提取條件下70%乙醇[17]溶液中的活性。1 mg酶每分鐘水解生成1微克葡萄糖的量定義為一個(gè)活力單位U。

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取6只25 mL比色管,分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖于6支試管中,均用蒸餾水稀釋至1 mL,加3,5-二硝基水楊酸顯色劑3 mL,在沸水浴中煮沸顯色10 min,冷卻,定容至25 mL。在550 nm處比色測(cè)其OD值。以光密度為縱坐標(biāo)A,以葡萄糖微克數(shù)為橫坐標(biāo)m,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到方程:A=0.5867m-0.0096。

1.3.1.2 樣品測(cè)定 取1 mL酶液(0.05 mg/mL),沸水浴5 min,冷卻后加3 mL 0.5% CMC作為空白,取三支比色管,分別加入0.5% CMC 3 mL,酶液1 mL,混勻后與空白管一起于50 ℃水浴鍋中水浴30 min,取出,立即于沸水浴中煮沸10 min使酶失活,冷卻加入3 mL顯色液,再沸水浴10 min,冷卻后加蒸餾水定容至25 mL,混勻,于550 nm處測(cè)OD值。按照下式計(jì)算酶活力。

式中:X:酶活力(U/mg);N:試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù);m:OD值對(duì)應(yīng)的葡萄糖量;t:反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2 綠原酸得率的測(cè)定

1.3.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密稱(chēng)取綠原酸42.5 mg,無(wú)水乙醇溶液溶解,并定容于1000 mL的容量瓶中,搖勻,得到42.5 mg/L的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。取適量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液于500～200 nm范圍內(nèi)掃描,以無(wú)水乙醇溶液作參比,得到綠原酸在329 nm處有最大吸收峰,故選擇于329 nm處測(cè)量綠原酸的吸光度[18]。

準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別為2.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 μg/mL。以無(wú)水乙醇做參比液,在329 nm處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紫外吸光度OD。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。得到方程:A=0.0566C-0.0096,R2=0.9986。

1.3.2.2 樣品的測(cè)定 取蒲公英綠原酸提取液,用相應(yīng)的提取濃度的乙醇溶液定容至100 mL,得到待測(cè)溶液。以無(wú)水乙醇做參比液,用紫外分光光度計(jì)在329 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度OD。

綠原酸得率計(jì)算公式為[4]:

式中:Y:綠原酸得率(%);V:待測(cè)試樣液的體積(mL);X:待測(cè)試樣液的濃度(μg/mL);F:稀釋倍數(shù);m:蒲公英樣品質(zhì)量(μg)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)三次取平均值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖分析。選用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析處理,建立多元回歸數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)綠原酸得率的影響 纖維素酶添加量對(duì)綠原酸得率的影響如圖1所示。酶添加量為0.1%～0.5%,添加酶時(shí)各個(gè)濃度下酶的活性相同均為99.996 U/mg,70%乙醇酶解后不同酶添加量下酶活性的平均值為(99.985±0.005) U/mg。由圖1可以看出,在纖維素酶添加量為0.1%～0.3%時(shí),綠原酸得率上升,在0.3%～0.5%時(shí)綠原酸得率開(kāi)始下降。由于纖維素酶破壞了植物細(xì)胞壁,使包裹在細(xì)胞內(nèi)的綠原酸釋放出來(lái)[17],但隨纖維素酶濃度的增加,細(xì)胞壁破壞加劇,胞內(nèi)其他干擾性物質(zhì)也隨之釋出,可能通過(guò)影響提取過(guò)程而降低綠原酸的得率。所以選擇酶添加量0.2%～0.4%(占干料的百分比)為響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)綠原酸得率的影響 Fig.1 Effect of cellulase addition on the yield of chlorogenic acid

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響 酶解時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響如圖2所示。添加酶時(shí)酶的活性為99.996 U/mg,70%乙醇酶解后不同酶解時(shí)間下酶活性的平均值為(99.984±0.008) U/mg。由圖2可以看出,蒲公英中綠原酸的得率呈先上升后下降的趨勢(shì),在酶解時(shí)間為1 h時(shí),蒲公英綠原酸得率最高。分析原因是,酶解時(shí)間不足,綠原酸得不到有效釋出;但酶解時(shí)間延長(zhǎng),酶活性得到充分利用,酶促反應(yīng)完全,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)引起綠原酸的氧化分解[19],綠原酸得率反而下降。酶解時(shí)間的變化,對(duì)綠原酸的得率有較大的影響。因此,選取酶解時(shí)間0.5～1.5 h為響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of chlorogenic acid

2.1.3 超聲功率對(duì)綠原酸得率的影響 超聲功率對(duì)綠原酸得率的影響如圖3所示,可以看出,當(dāng)功率50～150 W,綠原酸得率增加;在150～250 W時(shí),綠原酸得率逐漸下降。這是因?yàn)槌暪β试酱?質(zhì)點(diǎn)的振動(dòng)速度越大,物料內(nèi)部的傳質(zhì)更為劇烈[20-21],而使細(xì)胞壁遭到破壞[22],有效成分容易滲出,從而使得率明顯提高;但隨超聲功率的增大,綠原酸得率降低。所以選取適宜的超聲功率范圍為100～200 W為響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍。

圖3 超聲功率對(duì)綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of chlorogenic acid

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響 超聲時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響如圖4所示,可以看出,綠原酸得率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng),呈現(xiàn)先上升后又有所下降的趨勢(shì),這是因?yàn)槌暡▽?duì)植物細(xì)胞壁有破壞作用,隨超聲時(shí)間增加,對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度加大,綠原酸類(lèi)物質(zhì)易于溶出[23];隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),細(xì)胞壁被完全破壞,細(xì)胞內(nèi)其他干擾性物質(zhì)溶出,可能通過(guò)影響提取過(guò)程而使綠原酸得率下降。所以選取適宜超聲時(shí)間范圍1～2 h為響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平(表1),進(jìn)行了四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的綠原酸提取實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface test

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中綠原酸得率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析,得到回歸方程:Y=2.09-0.59A-0.073B+0.081C+0.082D-0.22AB+0.095AC-0.032AD+0.045BC+0.020BD+0.087CD-0.11A2-0.16B2-0.19C2-0.17D2

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 軟件分析得到各因素對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面和等高線圖,見(jiàn)圖5～圖10。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖,可直觀的反應(yīng)各因素的交互作用[24-25]。由圖5和表3可知,交互作用項(xiàng)纖維素酶添加量和酶解時(shí)間的等高線圖為橢圓形,且p<0.0001,說(shuō)明纖維素酶添加量和纖維素酶酶解時(shí)間交互作用極顯著。由圖6、圖10和表3可知,交互作用項(xiàng)纖維素酶添加量和超聲功率的等高線圖,超聲功率和超聲時(shí)間的等高線圖均為橢圓形,且p<0.05,說(shuō)明兩組交互作用項(xiàng)的交互作用均顯著。由圖7、圖8、圖9和表3可知,交互作用項(xiàng)的等高線圖趨近圓形,且p>0.05,說(shuō)明交互作用效果不顯著。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 纖維素酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)綠原酸得率的影響Fig.5 Effect of the interaction of cellulase addition and enzymolysis time on the yield of chlorogenic acid

圖6 纖維素酶添加量和超聲功率的交互作用對(duì)綠原酸得率的影響Fig.6 Effect of the interaction of cellulase addition and ultrasonic power on the yield of chlorogenic acid

圖7 纖維素酶添加量和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)綠原酸得率的影響Fig.7 Effect of the interaction of cellulase addition and ultrasound time on the yield of chlorogenic acid

圖8 酶解時(shí)間和超聲功率的交互作用對(duì)綠原酸得率的影響Fig.8 Effect of interaction enzymolysis time and ultrasonic power on the yield of chlorogenic acid

圖9 酶解時(shí)間和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)綠原酸得率的影響Fig.9 Effect of enzymatic hydrolysis time and ultrasound time on the yield of chlorogenic acid

圖10 超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)綠原酸得率的影響Fig.10 Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用軟件對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最佳提取條件:酶添加量為0.29%,酶解時(shí)長(zhǎng)為0.95 h,超聲功率162.51 W,超聲時(shí)間1.65 h,在此條件下綠原酸的得率最高,達(dá)到了2.12%。但為了驗(yàn)證模型的有效性,并結(jié)合實(shí)際情況,將最佳工藝條件調(diào)整為:纖維素酶添加量0.3%(占干料的百分比),酶解時(shí)間為1.0 h,超聲功率為163 W,超聲時(shí)間為1.7 h,在此工藝條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)并取其平均值,最終綠原酸得率為2.14%±0.02%,與模型預(yù)測(cè)值(2.12%)相近。

通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了提取蒲公英中綠原酸的優(yōu)化回歸方程模型,經(jīng)過(guò)分析該模型擬合度良好。與傳統(tǒng)的提取方法相比,提取率明顯的提高,李立順[26]采用傳統(tǒng)的超聲波方法提取蒲公英中綠原酸,單純的使用超聲波方法,細(xì)胞壁破壞不完全,綠原酸不能大部分釋放出,使其得率僅為0.25%,相比之下,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了1.89%。倪悅[27]采用酶法提取蒲公英中綠原酸,酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),在提取過(guò)程中容易導(dǎo)致酶失活性,而影響綠原酸的析出,其得率為0.53%,相比之下本實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了1.61%。本文采用酶解和超聲聯(lián)用的方法,先讓酶作用后,細(xì)胞壁上的纖維素有部分降解,甚至有些細(xì)胞會(huì)破裂,有利于超聲波的進(jìn)一步分解,促進(jìn)綠原酸的釋放,而先用超聲波時(shí),細(xì)胞壁由于纖維素的保護(hù)作用,超聲波的破碎作用有限,故選用先酶解后超聲波提取方法。

3 結(jié)論

本文采用酶解-超聲組合方法提取蒲公英中綠原酸。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化,獲得蒲公英中綠原酸提取的最優(yōu)工藝條件為:乙醇濃度70%，纖維素加酶量0.3%,酶解時(shí)間為1.0 h,酶解pH為4,酶解溫度50 ℃,超聲功率163 W,超聲時(shí)間1.7 h,料液比1∶20 g/mL,在此條件下,綠原酸得率為2.14%。研究結(jié)果表明:酶解超聲組合方法較適合提取蒲公英中的綠原酸,響應(yīng)面分析法較好地優(yōu)化了提取工藝,在最優(yōu)提取工藝條件下,綠原酸得率達(dá)2.14%,與現(xiàn)有同類(lèi)研究相比,本方法可有效提高綠原酸的提取得率。本研究為蒲公英的精深加工及綜合利用提供有益的探究及參考。

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