王 樂,李 麗,牟海津

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

巖藻黃素(fucoxanthin)亦稱巖藻黃質(zhì)、褐藻素,是一種脂溶性天然類胡蘿卜素,為褐藻、硅藻、金藻及黃綠藻所含的色素,在褐藻中的量很高,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。其外觀為黃色粉末,不溶于水,易溶于乙醇。在偏酸性溶液、弱光和低溫下比較穩(wěn)定;在弱酸、弱堿條件下,發(fā)生顏色可逆變化;在強堿、強光或高溫條件下則被破壞[1]。已經(jīng)有研究證明巖藻黃素具有一定的抗癌、抗炎、抗氧化、抗肥胖等生物活性[2-6]。

圖1 巖藻黃素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of fucoxanthin

鼠尾藻(Sargassumthunbergii(Mert.)O’Kuntze)屬于馬尾藻科馬尾藻屬,是太平洋西部特有的暖溫帶性海藻,是我國沿海常見的一種經(jīng)濟褐藻,主要分布于浙江東海近海區(qū)域、遼寧至福建沿海北起遼東半島,南至雷州半島的硇州島,均有分布[7]。目前,鼠尾藻主要作為海參的飼料,應(yīng)用于海參的養(yǎng)殖。國內(nèi)大多關(guān)注于海帶(Lam-inariajaponica)、裙帶菜(Undariapinnatifida)、羊棲菜(Sargassumfusiforme)中巖藻黃素的提取工藝,對鼠尾藻中巖藻黃素的提取純化工藝的報道很少,且傳統(tǒng)方法提取時間長、溶劑消耗多、提取成本高[8-10],這嚴重制約了鼠尾藻巖藻黃素的大力開發(fā)以及工業(yè)化生產(chǎn)。

本文以鼠尾藻為原料,首先利用超聲波輔助提取法和響應(yīng)曲面法對巖藻黃素的提取工藝進行優(yōu)化,然后運用硅膠層析柱對巖藻黃素粗品進行純化,最后借助高效液相色譜法和質(zhì)譜分析法對巖藻黃素進行分析。這不僅為鼠尾藻的大力開發(fā)利用提供了新的方向,同時也為制備高純度巖藻黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠尾藻 浙江舟山;200～300 目層析柱硅膠 青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司;醋酸銨 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司;L-抗壞血酸 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;乙腈 美國Merck公司;甲醇 美國Merck公司;巖藻黃素標品 純度≥99%,Sigma-Aldrich試劑公司。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀、Agilent 1260 Infinity/6410B液質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent公司;Millipore Q超純水器 美國Millipore公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JA1003分析天平 上海天平儀器廠;TQ-2000Y粉碎機 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠尾藻干粉的制備 新鮮的鼠尾藻用自來水清洗,紗絹過濾去除多余水分,置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至恒重。干燥后的鼠尾藻用粉碎機粉碎,過60目篩,制得鼠尾藻干粉。

1.2.2 鼠尾藻巖藻黃素的提取 參照閆相勇等[10]的方法并做適當調(diào)整：精確稱取一定量的鼠尾藻干粉和L-抗壞血酸，按照一定的液料比與一定體積分數(shù)的乙醇溶液均勻混合，在一定的超聲溫度下提取一定時間，提取液于4800 r/min離心20 min后取上清液測定吸光值，計算巖藻黃素得率。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乙醇體積分數(shù)對巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,提取2次,取上清液,測定吸光值,計算巖藻黃素得率。

1.2.3.2 超聲時間對巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,分別超聲10、20、30、40、50、60 min,提取2次,取上清液,測定吸光值,計算巖藻黃素得率。

1.2.3.3 超聲溫度對巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于超聲波清洗器中,設(shè)置溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,超聲30 min,提取2次,取上清液,測定吸光值,計算巖藻黃素得率。

1.2.3.4 液料比對巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,分別按液料比為4、7、10、13、15 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,取上清液,提取2次,測定吸光值,計算巖藻黃素得率。

1.2.3.5 L-抗壞血酸添加量對巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,分別加入0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,提取2次,取上清液,測定吸光值,計算巖藻黃素得率。

1.2.3.6 提取次數(shù)對巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,分別提取1次、2次、3次,取上清液,測定吸光值,計算巖藻黃素得率。

1.2.4 巖藻黃素響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗設(shè)計 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件Design Expert 8.0所提供的 Box-Behnken 模型[12-13],以超聲溫度(A)、超聲時間(B)和乙醇體積分數(shù)(C)三因素為自變量,巖藻黃素得率為響應(yīng)值,設(shè)計出三因素三水平的實驗。實驗因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levers of response surface test

1.2.5 鼠尾藻巖藻黃素的純化 將粗提液于45 ℃減壓濃縮至原體積的1/5,濃縮液用三倍體積的石油醚在室溫下萃取30～60 min,萃取3次,合并提取液,45 ℃減壓濃縮至原體積的1/5,濃縮液用硅膠柱(16 mm×400 mm)進行純化,以石油醚∶乙酸乙酯(7∶1、5∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3)混合溶劑為洗脫液,分別洗脫三個柱體積,洗脫速度為1 mL/min,收集分離物中金黃色液體,即鼠尾藻巖藻黃素純化物。放入棕色瓶中,4 ℃冰箱避光保存。

1.2.6 高效液相色譜法測巖藻黃素含量 取巖藻黃素醇提液和硅膠柱分離純化液進行HPLC色譜鑒定。色譜條件[11]:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm×4.6 mm×250 mm),檢測波長:450 nm,柱溫:30 ℃,流動相:乙腈∶甲醇∶0.1%醋酸銨(V/V/V,75∶15∶10),流速:1 mL/min。

精確稱取1 mg巖藻黃素標品,用甲醇定容至5.0 mL,配制成濃度分別為200 μg/mL的標準液。分別取0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.15 mL標準液,用甲醇定容至0.4 mL,配制成濃度分別為5、10、25、40、50、75 μg/mL的巖藻黃素溶液,采用HPLC法測定巖藻黃素含量并繪制標準曲線,各濃度梯度重復(fù)測定三次,取平均值。以巖藻黃素峰面積(Y)對其濃度(X)進行線性回歸,得巖藻黃素線性回歸方程為Y=108.79 X+41.616(R2=0.9994),根據(jù)標準曲線計算巖藻黃素含量。

1.2.7 巖藻黃素質(zhì)譜(ESI/MS)分析 將硅膠層析柱純化后的巖藻黃素溶液上樣質(zhì)譜分析。采用電噴霧(ESI)質(zhì)譜直接進樣法,正離子檢測模式,電子轟擊能量70 eV,掃描范圍為100～1000 m/z,柱流速1.0 μL/min,通過進樣閥將樣品溶液送入儀器中進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對巖藻黃素得率的影響 由圖2可知,當乙醇濃度在50%至90%之間時,巖藻黃素得率隨著乙醇濃度的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的過程,當乙醇濃度達到80%時,巖藻黃素得率達到了最大值。這可能是因為當乙醇濃度為80%時,巖藻黃素的極性與溶劑的極性相近,所以巖藻黃素得率較高。因此選擇 80%的乙醇作為實驗較佳的乙醇體積分數(shù)。

圖2 乙醇體積分數(shù)對巖藻黃素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of fucoxanthin

2.1.2 超聲時間對巖藻黃素得率的影響 由圖3可知,超聲時間在10～30 min內(nèi),巖藻黃素得率隨著超聲時間的延長逐漸增大,當提取時間超過30 min 時得率開始逐漸下降。這可能是由于在短時間內(nèi),超聲作用促進了細胞的破裂,巖藻黃素分子不斷擴散與提取溶劑發(fā)生作用,提取效果顯著提高,但是超過一定的時間后,一些如熱效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)對巖藻黃素的破壞,導(dǎo)致巖藻黃素的得率下降[11]。因此選擇30 min作為實驗較佳提取時間。

圖3 超聲時間對巖藻黃素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on extraction yield of fucoxanthin

2.1.3 超聲起始溫度對巖藻黃素得率的影響 由圖4可知,巖藻黃素得率隨著超聲起始溫度的升高先增大后減小,在達到50 ℃時,巖藻黃素得率達到最大值;在50～70 ℃時,巖藻黃素得率有所下降,這可能是剛開始隨著溫度的升高溶劑體系內(nèi)的分子運動加劇,提高了巖藻黃素得率,但溫度超過50 ℃時,由于受到超聲波的機械效應(yīng)和熱效應(yīng),使巖藻黃素的穩(wěn)定性發(fā)生改變,導(dǎo)致巖藻黃素得率下降[14]。因此選擇50 ℃作為實驗較佳溫度。

圖4 超聲起始溫度對巖藻黃素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on extraction yield of fucoxanthin

2.1.4 液料比對巖藻黃素得率的影響 由圖5可知,在液料比為10 mL/g之前,巖藻黃素得率隨溶劑用量的增大而增大,并在10 mL/g時達到最大值,之后繼續(xù)增加溶劑用量,得率上升趨勢緩慢。這主要是由于料液比的增大使得巖藻黃素與有機溶劑的接觸更加的充分,從而使得巖藻黃素得率升高,但是這種擴散所帶來的升高是有限度的?？紤]到提取成本,選擇液料比為10 mL/g作為實驗的較佳液料比。

圖5 液料比對巖藻黃素得率的影響Fig.5 Effect of liquid/material ratio on extraction yield of fucoxanthin

2.1.5 L-抗壞血酸添加量對巖藻黃素得率的影響 由圖6可知,提取的過程中加入L-抗壞血酸可以有效提高巖藻黃素得率,這主要是由于抗壞血酸的抗氧化作用可以有效保護巖藻黃素在提取過程中不被氧化,使得巖藻黃素得率得到明顯地提高。綜合考慮后,選擇L-抗壞血酸的添加量為0.8%作為實驗的較佳提取條件。

圖6 L-抗壞血酸添加量對巖藻黃素得率的影響Fig.6 Effect of L-ascorbic acid concentration on extraction yield of fucoxanthin

2.1.6 提取次數(shù)對巖藻黃素得率的影響 由圖7可知,經(jīng)過兩次提取后,已經(jīng)提取出絕大部分的巖藻黃素,綜合考慮成本,以及長時間提取對巖藻黃素穩(wěn)定性的破壞等因素,最終選取提取2次為較佳提取次數(shù)。

圖7 提取次數(shù)對巖藻黃素得率的影響Fig.7 Effect of extraction times on extraction yield of fucoxanthin

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗

2.2.1 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素實驗基礎(chǔ)上,固定液料比為10 mL/g、L-抗壞血酸0.8%,提取2次,以鼠尾藻中巖藻黃素得率為響應(yīng)值,選擇超聲時間、超聲起始溫度和乙醇體積分數(shù)3個因素,做三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計,實驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗 應(yīng)用Design Expert進行回歸擬合分析,可得鼠尾藻中巖藻黃素得率的回歸模型為:

巖藻黃素得率(mg/g)=0.46+0.011A+8.000×10-3B+8.750×10-4C-1.750×10-3AB-8.000×10-3AC-5.750×10-3BC-0.028A2-0.025B2-0.040C2。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

響應(yīng)面法可以優(yōu)化因素間的相互作用,并得到相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖進而對各因素進行分析,當圖中等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著[15]。

圖8A表示超聲時間一定時,超聲時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用。由圖可知,當乙醇體積分數(shù)一定時,隨著超聲時間的延長,巖藻黃素的得率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢;當超聲時間一定時,隨著乙醇體積分數(shù)的增大,巖藻黃素得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由響應(yīng)曲面圖可知其曲面較陡,兩者交互作用較顯著。

圖8B表示超聲時間一定時,乙醇體積分數(shù)和超聲溫度的交互作用?？芍?當乙醇體積分數(shù)一定時,隨著超聲起始溫度的升高,巖藻黃素得率呈先增大后減小的趨勢。當超聲溫度一定時,乙醇體積分數(shù)對巖藻黃素得率的影響趨勢相同。由其響應(yīng)曲面圖中的曲面情況可知乙醇體積分數(shù)和超聲溫度對巖藻黃素得率的交互效應(yīng)影響顯著。

圖8 不同交互作用對巖藻黃素提取率的影響Fig.8 Effects of different interactions on extraction yield of fucoxanthin

圖8C表示乙醇體積分數(shù)一定時,超聲時間和超聲溫度之間的交互作用。當超聲溫度一定時,隨著超聲時間的延長,巖藻黃素的得率增大,超聲時間超過30 min后,其得率有所下降;當超聲時間一定時,隨著超聲溫度的提高,巖藻黃素得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。響應(yīng)曲面圖中相應(yīng)表現(xiàn)為曲線較為平滑,表明超聲時間和超聲溫度對巖藻黃素得率的交互效應(yīng)影響不顯著。

2.2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗證 通過響應(yīng)面法得到超聲波輔助提取鼠尾藻巖藻黃素最佳工藝條件為超聲溫度51.96 ℃,超聲時間為31.52 min,乙醇體積分數(shù)79.80%,此時巖藻黃素最大理論得率為0.462 mg/g。實際操作中確定的最佳工藝條件為超聲時間32 min、乙醇體積分數(shù)80%、超聲起始溫度52 ℃,在此條件下進行5次平行驗證實驗,得到的多酚平均得率為(0.455±0.046) mg/g,與理論值0.462 mg/g非常接近,證實了該模型的有效性。

2.3 巖藻黃素高效液相色譜法分析

分別選取巖藻黃素粗提液和經(jīng)過硅膠柱純化后的巖藻黃素純化物進行HPLC分析,結(jié)果如圖9所示,可以看出粗提液色譜圖中,出現(xiàn)了很多吸收峰,且峰型非常復(fù)雜,在7.497 min 出現(xiàn)的吸收峰與標準品吸收峰(7.950 min)對比,較為接近。而經(jīng)過硅膠柱純化后巖藻黃素樣品液相圖譜,如圖9(B),與巖藻黃素標品出峰保留時間基本一致,因此可判定該物質(zhì)為巖藻黃素,由此推之,粗提液中峰值保留時間為7.497 min的物質(zhì)亦為巖藻黃素。按照1.2.4所述方法,通過公式計算得純化后巖藻黃素得率為(0.048±0.002) mg/g,純度為86.88%±1.34%(峰面積所占百分比),而純化前的粗提液中巖藻黃素純度僅為23.16%±2.19%(峰面積所占百分比),可知樣品中巖藻黃素純度得到顯著提高,說明硅膠柱層析法適用于純化巖藻黃素,適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

圖9 巖藻黃素純化前(A),純化后(B)以及標準品(C)的HPLC圖譜Fig.9 HPLC analyses of fucoxanthin before purification(A), after purification(B)and standard(C)

2.4 巖藻黃素質(zhì)譜分析

圖10所示為純化后的巖藻黃素在ESI正離子模式下的質(zhì)譜圖。圖中出現(xiàn)較強的離子峰697.4[M+K]+、681.4[M+Na]+和準分子離子峰659.4[M+H]+,同時還出現(xiàn)了相對較弱的m/z 581.4[M+H-78]+、360.3、334.3、312.4、177.1、131.1。這些均符合巖藻黃素的特征碎片離子峰,與Britton G[16]報道一致。

圖10 純化后巖藻黃素質(zhì)譜圖Fig.10 MS chromatogram of fucoxanthin after purification

3 結(jié)論

本研究首先利用超聲波輔助提取鼠尾藻中的巖藻黃素,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化了鼠尾藻巖藻黃素的提取工藝,建立巖藻黃素的二次多項回歸模型,且擬合情況良好。實驗結(jié)果表明,最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)為80%(V/V),液料比為10 mL/g,L-抗壞血酸的添加量為0.8%,超聲起始溫度為52 ℃,超聲時間為32 min,在此條件下提取2次,巖藻黃素粗品得率為(0.455±0.046) mg/g。其次,本研究利用硅膠層析柱對提取的巖藻黃素粗品進行了純化,經(jīng)HPLC和MS鑒定,純化后巖藻黃素得率為(0.048±0.002) mg/g,純度高達86.88%±1.34%。而目前市場上高純度的巖藻黃素需求大、前景廣闊,此工藝提取時間短、效率高、有機試劑消耗少,適合于巖藻黃素大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),為制備高純度的巖藻黃素提供了新的參考依據(jù)。

[1]汪曙暉,薛長湖. 巖藻黃素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(6):408-410.

[2]徐戎,張悅,王倩,等. 昆布有效成分巖藻黃質(zhì)對人體7種腫瘤細胞增殖與凋亡的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2009,25(4):21-24.

[3]Kenji S,Kazuhiro O,Iliyana I,et al. Effects of fucoxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammationinvitroandinvivo[J]. Experimental Eye Research,2005,81:422-428.

[4]Hayato M,Masashi H,Tokutake S,et al. Fucoxanthin from edible seaweed,Undaria pinnatifida,shows antiobesity effect through UCP1 expression in white adipose tissues[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,332:392-397.

[5]Matsumoto M,Hosokawa M,Matsukawa N,et al. Suppressive effects of the marine carotenoids,fucoxanthin and fucoxanthinol on triglyceride absorption in lymph duct-cannulated rats[J]. European Journal of Nutrition,2010,49:243-249.

[6]Yan X J,Chuda Y,Suzuki M,et al. Fucoxanthin as the major antioxidant in Hijikia fusiformis,a common edible seaweed[J]. Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,1999,63(3):605-607.

[7]江茜,劉東,楊加波,等. 鼠尾藻的化學(xué)成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志,2012,47(12):948-952.

[8]趙鵬. 海帶中巖藻黃素的提取與純化工藝研究[D]. 北京:北京化工大學(xué),2010.

[9]秦云,孟麗媛,王鳳舞. 復(fù)合酶法提取海帶巖藻黃素及其抗氧化活性分析[J]. 食品科學(xué),2013,34(16):279-283.

[10]閆相勇,劉翼翔,吳永沛,等. 海帶巖藻黃素的提取及純化工藝研究[J]. 中國食品學(xué)報,2014,14(3):115-121.

[11]惠伯棣. 類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M]. 北京﹕中國輕工業(yè)出版社,2005﹕68-322.

[12]尹尚軍,徐濤,劉麗平,等. 羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(4)﹕272-275.

[13]費榮昌. 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理第四版[M]. 上海:華東師范大學(xué)出版社,2001:59-63.

[14]王銀羽. 鼠尾藻中巖藻黃質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及降血脂作用的研究[D]. 杭州:浙江工業(yè)大學(xué),2015.

[15]Box G E P,Hunter W G. Statistics for experiments:an introduction to design,data analysis and model building[M]. New York:Wiley,1990.

[16]Britton G,Liaaen-Jensen S,Pfander H,et al. Carotenoids[M]. Basel:Birkllauser Verlag,1995.