鞠守勇

(武漢職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院,湖北武漢 430074)

青霉素類(β-內(nèi)酰胺類)抗生素是我國畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用最普及的一類抗生素,畜產(chǎn)品中青霉素類抗生素殘留越來越引起人們的關(guān)注。長期攝入含有青霉素類抗生素殘留的食品將破壞人體胃腸道等菌群的平衡,引起腹瀉等癥狀;一部分對青霉素過敏人群長期食用青霉素超標的食物將引發(fā)過敏反應,輕者導致發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫痛等癥狀,嚴重時甚至引起呼吸困難、休克甚至危及生命[1]。2008年10月9日,國務院通過了《乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理條例》(國務院令第536號),將抗生素殘留檢測項目列為強制性檢測項目,并規(guī)定了各類抗生素在牛乳中的最高殘留限量。目前,牛奶和奶粉中青霉素殘留國家標準檢測方法為2008年12月31日發(fā)布的《GB/T 22975-2008牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,這種方法雖然具有靈敏度高、準確度高等優(yōu)點,但該方法需要的儀器設備昂貴,樣品前處理過程繁瑣。

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins,PBP)一般位于細菌細胞膜上,因為最初發(fā)現(xiàn)能和青霉素共價結(jié)合而得名。青霉素類(β-內(nèi)酰胺類)抗生素的結(jié)構(gòu)類似于肽聚糖合成前體物 D-Ala-D-Ala,這類抗生素能專一性地與細菌的PBP結(jié)合,抑制PBP酶的活性,干擾細胞壁肽聚糖的合成,最終殺死細菌[2-3]。根據(jù)PBP的相對分子質(zhì)量大小及催化活性不同,可以將PBP分為PBP1、PBP2、PBP3等三大類[4]。青霉素免疫檢測法利用青霉素結(jié)合蛋白與青霉素類抗生素的特異性相互作用和酶的高效催化反應達到快速檢測食品中青霉素殘留的目的,該方法操作簡單、成本低廉、檢測靈敏高、準確快速[5-7],越來越多的用于食品中抗生素及毒素殘留的檢測[6,8],這種檢測方法的核心就是與青霉素類抗生素特異性結(jié)合的PBP蛋白。近幾年,已經(jīng)從多種微生物中克隆到不同類型的青霉素結(jié)合蛋白,例如革蘭氏陽性菌中的肺炎鏈球菌、革蘭氏陰性菌中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和淋病奈瑟氏菌等。但是,目前克隆得到的PBP與β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合能力特異性結(jié)合能力比較差,制約著食品中青霉素殘留免疫檢測法的發(fā)展。

本文從蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiesis,Bt)中克隆并表達了一種與青霉素G具有高親和力的新型的蛋白質(zhì)Bt-PBP2,并證實該蛋白質(zhì)能與青霉素G發(fā)生特異性結(jié)合,利用Bt-PBP2作為抗原,設計了競爭酶聯(lián)法快速準確的測定牛奶中青霉素G的殘留的方法。該方法具有操作簡單,靈敏度高等特點,為進一步開發(fā)快速、高效青霉素殘留檢測試紙條設計奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇云金芽胞桿菌BMB171、大腸桿菌E.coliDH5α、大腸桿菌表達宿主E.coliBL21(DE3)、表達質(zhì)粒pET28a(+) Invitrogen公司；LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L,pH7.0～7.4,121 ℃滅菌30 min;限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker等分子生物學試劑 北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司;氯化鈉、青霉素G等常規(guī)生化試劑 國藥集團;DNA片段回收試劑盒 Omega公司;Monolith NT Protein Labeling Kit RED-NHS蛋白熒光標記試劑盒 德國NanoTemper Technologies公司。

Peltier Thermal Cycler(PTC-100TM)PCR儀 美國MJ Research公司;5415D離心機 德國Eppendorf 公司;恒溫培養(yǎng)箱 廣州醫(yī)療器械廠;GAS-2000凝膠成像系統(tǒng)3Y 美國柯達公司;DYY-11電泳儀 北京六一儀器廠;恒溫恒濕箱搖床 武漢瑞華儀器設備公司;MST,NT.115微量熱泳動儀 德國Nano Temper公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Bt總DNA的提取 挑取單菌落接種液體LB培養(yǎng)基,活化至對數(shù)生長中期;1%轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃,250 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長中期,收集菌體,按照薩姆布魯克[9]的方法提取蘇云金芽胞桿菌BMB171總DNA。

1.2.2 Bt中青霉素G結(jié)合蛋白基因Bt-pbp2的克隆 參照薩姆布魯克[9]的方法,以提取的Bt BMB171總DNA為模板,采用Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增。50 μL PCR反應體系:模板DNA基因組1 μL,引物P1和P2(10 μmol/L)各21 μL,dNTP 2 μL,Pfu DNA聚合酶1 μL,總反應體系50 μL。反應程序為94 ℃、5 min,95 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、2 min,30個循環(huán),72 ℃、10 min,25 ℃、1 s。

1.2.3 青霉素G結(jié)合蛋白基因Bt-pbp2的表達載體的構(gòu)建 參照薩姆布魯克[9]的方法,切膠回收的Bt-pbp2基因PCR產(chǎn)物,與載體pET-28a(+)共同在37 ℃NdeI和XhoI雙酶切4 h,瓊脂糖電泳后分別切膠回收外源和載體,T4連接酶將外源基因與pET-28a(+)于16 ℃過夜連接,CaCl2法轉(zhuǎn)化導入E.coliDH5α,涂布含有卡拉霉素LB平板。隨機挑取轉(zhuǎn)化子菌落PCR 驗證陽性克隆,選取三個陽性克隆,接種至含有卡拉霉素的液體LB培養(yǎng)基中抽取質(zhì)粒,酶切驗證,再測序驗證沒有發(fā)生點突變。提取重組載體pET28a(+)-pbp2轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coliBL21(DE3)。構(gòu)建含有pET28a(+)-pbp2的表達宿主菌E.coliBL21(DE3)命名為E.coliBt-PBP2。

1.2.4 青霉素結(jié)合蛋白Bt-PBP2的誘導表達 參照薩姆布魯克[9]的方法,將E.coliBt-PBP2在平板上挑取單菌落,接種含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜活化,將菌液按1/100比例加入新鮮的卡拉霉素LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長中期,加入IPTG誘導(IPTG終濃度為0.1 mmol/L)250 r/min,16 ℃培養(yǎng)過夜后將培養(yǎng)瓶置于冰上5 min;4 ℃,12000 r/min離心收集菌體,預冷的ddH2O重懸菌體沉淀,再次離心收集菌體,備用。

1.2.5 Bt-PBP2蛋白的純化 參照薩姆布魯克[9]的方法,用4 ℃的可溶結(jié)合緩沖液(10 mmol/L咪唑,NaCl 0.5 mol/L,20 mmol/L Tris-HCl,pH7.9)重懸菌體,置于冰上超聲波破碎至懸液變澄清;4 ℃,12000 r/min離心60 min,收集上清液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后緩緩加入到Ni瓊脂糖凝膠柱中,隨后使用15倍柱體積的可溶結(jié)合緩沖液沖洗柱子,洗脫雜蛋白;然后用洗脫緩沖液(500 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH=7.9)洗脫柱子,收集洗脫液。隨后15 kDa截流管去除咪唑,無菌水重新溶解得到純化蛋白質(zhì)Bt-PBP2。

1.2.6 微量熱泳動儀(MST)測Bt-PBP2蛋白與青霉素G相互作用 參照NanoTemper Monolith NT Protein Labeling Kit RED-NHS試劑盒操作步驟將純化Bt-PBP2蛋白進行熒光標記。測定前,將蛋白樣品加入0.1%的吐溫-20以減小蛋白在毛細管內(nèi)壁的附著,用PBS稀釋一定倍數(shù)將已經(jīng)標記的Bt-PBP2蛋白樣品熒光值調(diào)節(jié)至在200～1500范圍之間;隨后將青霉素G溶于PBS 緩沖溶液中配制成將小分子配體,用PBS將小分子配體青霉素G進行梯度稀釋成16個不同濃度梯度,其中最高濃度為128 μg/L依次兩倍稀釋至最低濃度0.00375 μg/L;稀釋后的蛋白樣品和小分子配體化合物于12000 r/min,4 ℃離心5 min,隨后分別取上清;將蛋白樣品上清與16個不同濃度的青霉素G按1∶1混合,填充16根毛細管,進行微量熱泳動分析。

1.2.7 利用Bt-PBP2蛋白測定牛奶中青霉素G殘留

1.2.7.1 標準樣品的制備 用PBS配制濃度梯度為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0 μg/L的青霉素G標準溶液。用辣根過氧化酶標記的青霉素(HRP-Amp)溶于PBS緩沖溶液,終濃度為2 g/L。

1.2.7.2 制板 純化的Bt-PBP2蛋白作為包被蛋白,酶標板每孔中加入Bt-PBP2蛋白100 μL(濃度400 μg/L),4 ℃放置過夜,PBST(PBS+0.05% Tween-20)洗一遍拍干,加2% BSA 封閉液150 μL,37 ℃孵育3 h,PBS洗滌三次,拍干。

1.2.7.3 加樣 各孔加入100 μL青霉素G標準溶液,37 ℃孵育30 h,PBST洗滌三次,拍干。每孔中加入50 μL HRP-Amp,37 ℃孵育30 min,傾去孔內(nèi)液體,PBST洗滌三次,拍干。

1.2.7.4 測定吸光度值A450加入100 μL新配制的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB),室溫避光孵育10 min,立即向每孔中加入50 μL 終止液(2 mol/L),藍色變黃色,迅速放入酶標儀中,450 nm波長測定吸光度值A450。

1.2.7.5 添加回收率 在不含有青霉素G的脫脂牛奶中添加一定量的青霉素G,Amp的終濃度為5、10、20、40 ng/mL,按以上方法檢測,酶標板微孔中450 nm處的吸光度A450,每個樣品做6個平行樣(n=6)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗至少重復三次以上,所得數(shù)據(jù)用SPSS進行方差分析,采用OriginPro 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt-pbp2基因的克隆

根據(jù)已報道的金黃色葡萄球菌(Streptococcuspneumoniae)R6菌株青霉素結(jié)合蛋白PBP2公布的蛋白質(zhì)序列(GI:15902348),通過tBLAST比對蘇云金芽胞桿菌BMB171中的基因組[10],發(fā)現(xiàn)一個覆蓋度僅為94%,相似度為31%的新型蛋白質(zhì),命名為Bt-PBP2,其基因命名為Bt-pbp2。按照1.2.1方法提取蘇云金芽胞桿菌BMB171的總DNA,上游引物P1:CCGCATATGATGAAGTGGACAAAAAG,下游引物P2:CCGCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAA,擴增Bt-pbp2基因,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,大小約2.1 kb,與預期大小一致(圖1),切膠回收PCR擴增片段,測序,結(jié)果表明所獲得片段的核苷酸序列與Bt BMB171中一致,證明成功克隆到Bt-pbp2基因。

圖1 PCR擴增Bt-pbp2基因的凝膠電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis of gene Bt-pbp2 amplification products注：M是DNAMaker,1、2PCR擴增得到的Bt-pbp2基因。

2.2 表達載體pET28a(+)-pbp2的構(gòu)建

回收的PCR產(chǎn)物與載體pET28a(+)分別用NdeI和XhoI雙酶切,T4連接酶連接成pET28a(+)-pbp2重組載體(圖2),菌落PCR驗證,隨機選取三個克隆子提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRV,XhoI酶切驗證為3.9 kb,3.4 kb符合預期(圖3)。測序結(jié)果表明pbp2基因序列與預期序列完全一致,pET28a(+)-pbp2重組載體構(gòu)建成功。提取重組載體pET28a(+)-pbp2轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coliBL21(DE3)。構(gòu)建的含有pET28a(+)-pbp2的表達宿主菌E.coliBL21(DE3)命名為E.coliBt-PBP2。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-pbp2圖譜。Fig.2 The recombinant plasmid pET28a(+)-pbp2

圖3 pET28a(+)-pbp2用EcoRV,XhoI酶切片段Fig.3 The cleaved fragments of pET28a(+)-pbp2 using EcoRV,XhoI restriction enzyme 注：M是DNA分子量標準；1,2是pET28a(+)-pbp2用EcoRV,XhoI酶切片段。

2.3 Bt-PBP2蛋白的誘導表達及純化

按照1.2.4方法通過IPTG誘導表達蛋白質(zhì),按照1.2.5方法提取蛋白質(zhì)Bt-PBP2,SDS-PAGE鑒定為單一條帶無明顯雜蛋白,蛋白質(zhì)分子量約為78 kDa,大小符合預期(圖4)。

圖4 SDS-PAGE檢測大腸桿菌中分離提取的Bt-PBP2蛋白質(zhì)Fig.4 The SDS-PAGE of Bt-PBP2 protein extracted from E.coli注：M是蛋白分子量標準；1是誘導上清；2是純化蛋白。

2.4 Bt-PBP2蛋白質(zhì)具有特異性結(jié)合青霉素G的活性

用15 kDa截流管去除咪唑,用PBS緩沖液重新溶解Bt-PBP2蛋白質(zhì),依照方法1.2.6將Bt-PBP2蛋白標記熒光,通過調(diào)整稀釋濃度,調(diào)節(jié)Bt-PBP2蛋白質(zhì)熒光值在200～1500范圍之間。用Prometheus NT.48測定兩者相互作用后微泳動變化情況,以熒光強度變化值為縱坐標,青霉素G的濃度為橫坐標,進行擬合曲線(圖5),經(jīng)測定Bt-PBP2蛋白與青霉素G親和常數(shù)Kd為10.36 nmol/L。該結(jié)果證明大腸桿菌表達純化的Bt-PBP2確實與青霉素G存在著特異性相互作用,該蛋白質(zhì)具有具有特異性結(jié)合青霉素G的活性。

圖5 帶熒光標記Bt-PBP2蛋白質(zhì)與不同濃度青霉素G結(jié)合后熱泳動變化Fig.5 The thermophoretic movement of fluorescent Bt-PBP2 proteins changes upon binding to different concentrations of penicillin G

2.5 Bt-PBP2蛋白質(zhì)用于測定牛奶中青霉素G殘留

按照方法1.2.7,以標準樣品濃度為橫坐標,標準樣品的A450吸光度值為縱坐標,用SPSS軟件,繪制Bt-PBP2蛋白競爭性結(jié)合青霉素G標準曲線。當青霉素G濃度在4～256 μg/L的時候,吸光度與青霉素G濃度有線性關(guān)系A450=-0.1278 ln(CAmp)+1.1067,R2=0.9757。在不含有青霉素G的脫脂牛奶中添加一定量的青霉素G,添加終濃度分別為5、10、20 ng/mL,然后用以上方法平行檢測樣品中青霉素G的含量,每個樣品做6個平行樣(n=6)。測定結(jié)果表明,當牛奶中添加濃度分別是5、10、20 ng/mL時,其添加回收率分別平均達到 94.4%±6.32%、93.8%±5.72%、93.4%±5.24%;在添加濃度為0 ng/mL中,沒有出現(xiàn)假陽性,也沒有假陰性(表1)。以上結(jié)果表明Bt-PBP2蛋白質(zhì)可用于定量測定牛奶中青霉素G的殘留。

表1 添加回收率Table 1 The recovery rate

3 結(jié)論

青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)因為最初發(fā)現(xiàn)能和青霉素共價結(jié)合而得名,PBPs的生物學功能現(xiàn)在研究比較清楚的是革蘭氏陰性細菌大腸桿菌(E.coli)的PBPs,大腸桿菌含有8種PBPs分別是PBP1～PBP8,其中PBP1、PBP2、PBP3主要負責維持細胞的形態(tài),維持大腸桿菌的張力,與細菌分裂有關(guān),PBP4具有D,D-羧肽酶和D,D-內(nèi)肽酶活性,PBP5、PBP6的羧基末端可穩(wěn)定蛋白質(zhì),穩(wěn)定肽聚糖結(jié)構(gòu);PBP7、PBP8具有 D,D-內(nèi)肽酶的活性[3]。此外,在革蘭氏陽性細菌中,肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)耐藥菌株和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)耐甲氧西林型菌株的PBPs研究比較多,其研究重點在于這些耐藥菌株的PBPs如何喪失了與β-內(nèi)酰胺類抗生素共價結(jié)合的能力[11-14],早在1996年肺炎鏈球菌中PBP2x的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析出來[15],隨后研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌共有6種PBPs,分別為PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b和PBP3,其中PBP1a、PBP2a、PBP2x和PBP2b是β-內(nèi)酰胺類抗生素作用的作用靶點,在肺炎鏈球菌耐藥菌株中與青霉素的親和力較低[11-12]。金黃色葡萄球菌存在5種PBPs,它們分別是PBP1、PBP2、PBP3、PBP4及PBP2b[3,16-17],2002年耐甲氧西林型金黃色葡萄球菌的PBP2a晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來[18]。國外利用來自肺炎鏈球菌的PBP2x作為受體蛋白,成功研發(fā)出快速檢測青霉素類抗生素殘留的試劑盒,比如 Randox公司[3-4,19]。2008年,李鐵柱等[20]利用大腸桿菌表達了出了青霉素結(jié)合蛋白PBP2x并證實了可以用于牛乳青霉素殘留檢測中的應用,但尚未有商品化的試劑盒推出。

本文克隆并表達了一種新型青霉素結(jié)合蛋白Bt-PBP2,并證實其與青霉素G有特異性相互作用,與肺炎鏈球菌的PBP2x相比其覆蓋度僅為94%,相似度為31%,其與青霉素G的Kd值比肺炎鏈球菌的PBP2x略小,利用該蛋白質(zhì)與青霉素G特異性結(jié)合的

能力,開發(fā)設計了牛奶中青霉素G殘留的檢測方法;回收率達到93.4%以上,在添加濃度為0 ng/mL中,沒有出現(xiàn)假陽性,也沒有假陰性,以上結(jié)果表明Bt-PBP2蛋白質(zhì)可用于定量測定牛奶中青霉素G的殘留。該方法樣品前處理過程簡單方便,不需要儀器設備,方便用于牛奶收儲站進行現(xiàn)場的快速檢測,為進一步開發(fā)快速、高效的青霉素殘留檢測試紙條設計奠定了基礎。

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