李思寧,唐善虎,毛濛蘭,胡 洋

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

酸奶是以鮮牛奶為主要原料,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而形成的一種風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富的功能性乳制品[1]。在實(shí)際的生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過程中,凝固型酸奶普遍存在因凝膠脆弱導(dǎo)致組織狀態(tài)破壞及乳清析出等問題,嚴(yán)重影響了酸奶的品質(zhì)[2],這些缺陷可以通過添加穩(wěn)定增稠劑或者蛋白質(zhì)交聯(lián)改性來解決。

目前,牛奶蛋白的交聯(lián)改性研究主要集中于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)的應(yīng)用。TG酶是一種催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng),通過轉(zhuǎn)谷氨酞胺作用形成共價(jià)化合物的聚合酶[3]。Schorsch等[4-5]研究表明,在發(fā)酵階段,牛奶中的酪蛋白膠束會(huì)受TG酶的影響而減少分散。蘇海龍[6]研究了TG酶在凝固型酸奶中的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)加入TG酶可以使凝固型酸奶的乳清析出率降低,持水力提高,表觀黏度增加,感官品質(zhì)提高。呂佳平等[7]進(jìn)行了TG酶提高酸奶品質(zhì)的工藝研究,并優(yōu)化了酶的應(yīng)用工藝及技術(shù)參數(shù),結(jié)果表明酶的處理方式為反應(yīng)后不滅酶,酶的適宜添加量為0.15 g/L。綜上所述,TG酶可改善酸奶品質(zhì)。

漆酶(Laccase)是一種多酚氧化酶,含4個(gè)Cu2+,聚合蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì),也可在酚酸存在的條件下使乳清蛋白發(fā)生交聯(lián)聚合[8]。Mokoonlall[9]研究了漆酶對酸奶和奶酪蛋白質(zhì)的氧化作用,發(fā)現(xiàn)漆酶可加快酸奶凝乳,使酸奶的孔隙增多,而黏度和保質(zhì)期不受影響。Wang[10]認(rèn)為漆酶劑量是影響其在牛奶中氧化作用的重要因素,低劑量條件下漆酶可使蛋白發(fā)生有效交聯(lián),轉(zhuǎn)化為更高分子量的蛋白質(zhì)聚合物,蛋白質(zhì)流變學(xué)特性增強(qiáng),但高劑量漆酶會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生降解,破壞牛奶品質(zhì)。關(guān)于漆酶交聯(lián)對乳蛋白游離氨基酸變化率、酸奶感官、質(zhì)構(gòu)、乳蛋白質(zhì)變化及微觀結(jié)構(gòu)品質(zhì)變化的影響尚未見報(bào)道。

阿魏酸(Ferulic Acid,FA)是植物界普遍存在的一種酚酸,主要使用麥麩、玉米麩皮等作為原材料來提取[11-12]。阿魏酸在食品中的應(yīng)用非常廣泛,日本已批準(zhǔn)其作為抗氧化劑用于食品防腐保鮮。阿魏酸也可作為食品交聯(lián)劑,結(jié)合蛋白質(zhì)[13-14]。在制備可食性蛋白膜時(shí),阿魏酸能增加膜的機(jī)械強(qiáng)度,并降低膜對水蒸氣和氧氣的透性[15]。阿魏酸也可通過減少蛋白質(zhì)中游離氨基含量,避免蛋白質(zhì)中游離氨基引起交聯(lián)而增加乳品在加熱過程中的熱穩(wěn)定性[16]。然而,阿魏酸與漆酶結(jié)合用于酸奶蛋白質(zhì)交聯(lián)對酸奶的品質(zhì)影響也未見報(bào)道。

本文通過在雙歧桿菌益生菌酸奶制備過程中添加TG酶和漆酶,對比兩種酶在酸奶中蛋白質(zhì)交聯(lián)的作用及對益生菌酸奶質(zhì)構(gòu)及組織結(jié)構(gòu)變化的影響,并通過添加阿魏酸改善漆酶酸奶的品質(zhì),旨在為解決凝固型酸奶的品質(zhì)缺陷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛奶(蛋白質(zhì)含量2.84 g/100 g) 四川新華西乳業(yè)有限公司;蔗糖 太古糖業(yè);混合發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌) 北京川秀科技有限公司;雙歧桿菌 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(活力≥100 U/g) 湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司;漆酶(活力≥100 U/g) 德國Ruibio公司;阿魏酸、戊二醛(電鏡專用) 上海Aladdin公司;電泳用蛋白Marker 天根生化科技有限公司;緩沖液(5×) 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;L-亮氨酸、鄰苯二甲醛(OPA)、甲醇、三氯乙酸(TCA)、四硼酸鈉、β-巰基乙醇、冰乙酸、無水乙醇、溴酚藍(lán)、叔丁醇 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺(Acr)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、過硫酸銨(APS) 均為電泳級,美國Sigma公司。

TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;NS1001L型高壓均質(zhì)機(jī) 意大利Niro Soavi公司;BROOKFIELD DV-Ⅲ Ultra流變儀 美國Brookfield公司;JSM-7500F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM) 日本電子株式會(huì)社;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;UV-2102 PCS型紫外分光光度計(jì) 龍尼克儀器有限公司;Mini 電泳槽 美國Bio-Rad公司;DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠;Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;ALPHA 1-4 LSC型凍干機(jī) 德國Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 益生菌酸奶制備流程及操作要點(diǎn) 益生菌酸奶制備工藝流程:

雙歧桿菌活化:取100 mL鮮牛奶,加入1%的雙歧桿菌,37 ℃恒溫培養(yǎng)至凝乳。取10 g凝乳,另加100 mL鮮牛奶,攪拌均勻,37 ℃恒溫培養(yǎng),凝固后放入4 ℃冰箱保存,備用。

在新鮮牛奶中加入6%蔗糖,攪拌均勻。將調(diào)配好的奶預(yù)熱到60 ℃,采用20 MPa壓力均質(zhì)2次。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同的酶,交聯(lián)溫度50 ℃,交聯(lián)時(shí)間1 h,加熱至90 ℃保持15 min進(jìn)行滅酶和殺菌,并快速冷卻至45 ℃左右;接種1‰保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵劑及5%活化后的雙歧桿菌,在42 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)(30°傾角傾斜發(fā)酵而料液無流動(dòng))后,取出放在4 ℃后熟36 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 TG酶對益生菌酸奶品質(zhì)的影響 TG酶使用量選擇0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 U/g。通過游離氨基變化率、感官、質(zhì)構(gòu)、表觀黏度對后熟后的酸奶進(jìn)行分析,確定TG酶的最佳添加量。

1.2.2.2 漆酶對益生菌酸奶品質(zhì)的影響 漆酶使用量選擇0、0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 U/g。通過游離氨基變化率、感官、質(zhì)構(gòu)、表觀黏度對后熟后的酸奶進(jìn)行分析,確定漆酶的最佳添加量。

1.2.2.3 阿魏酸對漆酶交聯(lián)益生菌酸奶品質(zhì)的影響 在牛奶中加入1.8 U/g漆酶的同時(shí),分別加入0、1.5、3、4.5、6、7.5 mmol/L的阿魏酸。通過游離氨基變化率、感官、質(zhì)構(gòu)、表觀黏度對后熟后的酸奶進(jìn)行分析,確定阿魏酸的最佳添加量。

根據(jù)以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)確定的TG酶、漆酶、阿魏酸+漆酶的最佳使用量,制備不同酶交聯(lián)益生菌酸奶,然后對TG酶交聯(lián)酸奶、漆酶交聯(lián)酸奶及阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶和對照組(不添加酶及阿魏酸)酸奶進(jìn)行電泳分析和電鏡掃描,評價(jià)酸奶的蛋白交聯(lián)情況及組織質(zhì)構(gòu)。

1.2.3 測定指標(biāo)

1.2.3.1 游離氨基變化率 參考Church[17]的方法測定游離氨基變化率。主要包括亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和蛋白質(zhì)中游離氨基含量的測定兩個(gè)步驟,具體為:a. 將亮氨酸配制成濃度為0、180、270、360、450、540、630、720 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,準(zhǔn)確移取300 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液與6 mL的鄰苯二甲醛試劑混合后搖勻,2 min后在340 nm下測定吸光度。以亮氨酸濃度為橫坐標(biāo),反應(yīng)后的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;b. 采用鄰苯二甲醛法測定蛋白質(zhì)中游離氨基含量,并計(jì)算游離氨基變化率。將40 mg的鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇中,分別加入100 mmol/L的四硼酸鈉25 mL、10% 十二烷基磺酸鈉 2.5 mL、β-巰基乙醇100 μL,加水定容至50 mL,配制鄰苯二甲醛試劑。取10 mL待測的酸奶樣品在4000 r/min離心20 min。取后熟后的酸奶樣品2.5 mL,分別加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的三氯乙酸、0.5 mL蒸餾水,在2000 r/min離心15 min。取清液300 μL,加入6 mL鄰苯二甲醛試劑,室溫下反應(yīng)2 min,340 nm下測定其吸光度值。根據(jù)亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酸奶中游離氨基的濃度;游離氨基變化率使用下面公式計(jì)算。

式中,M1:交聯(lián)前蛋白質(zhì)中游離氨基的含量,μg/mL;M2:交聯(lián)后蛋白質(zhì)中游離氨基含量,μg/mL。

1.2.3.2 感官評價(jià) 酸奶后熟完成后,隨機(jī)編號(hào),邀請經(jīng)過培訓(xùn)的10位食品專業(yè)人員，男女各一半,從產(chǎn)品的色澤、組織狀態(tài)、滋味以及氣味這四個(gè)方面進(jìn)行感官評定,逐項(xiàng)記分。評分標(biāo)準(zhǔn)[18]見表1。

表1 酸奶感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Score card for fermented milk sample

1.2.3.3 質(zhì)構(gòu) 質(zhì)構(gòu)測定參考李春紅[19]的方法:A/BE活塞探頭,探頭壓盤直徑:35 mm。其測定參數(shù)為:探頭運(yùn)行測前速率:1.0 mm/s;測試速率:1.0 mm/s;測后速率:10.0 mm/s;穿透測試距離:30 mm;觸發(fā)器類型(感應(yīng)力):Auto-10.0 g。

1.2.3.4 表觀黏度 用RVDV-III Ultra型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定酸奶的黏度值,轉(zhuǎn)子為RV5,設(shè)定轉(zhuǎn)速2.5 r/min,扭矩10%～100%,測定時(shí)間30 s。

1.2.3.5 SDS-PAGE 參考Laemmli[20]的方法并略作修改。將待測酸奶稀釋至蛋白質(zhì)濃度為5 mg/mL,取50 μL溶液于1.0 mL離心管中與樣品上樣緩沖液按1∶1混合均勻,沸水浴中煮5～10 min,12000 r/min離心10 min,除去不溶性顆粒,上清液用于電泳分析。用微型進(jìn)樣器上樣,每孔進(jìn)樣量為10 μL;樣品在80 V電壓進(jìn)行濃縮,待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后加壓至120 V,待溴酚藍(lán)距離下緣 0.5～1.0 cm 時(shí)結(jié)束電泳。然后對電泳膠進(jìn)行染色和脫色,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液對膠染色0.5～1 h,更換成脫色液,3 h后更換一次脫色液,脫色24 h,直至條帶清晰、背景色完全褪去為止;最后用蒸餾水清洗和用7%冰乙酸保存。SDS-PAGE分離膠和濃縮膠成分見表2。

表2 SDS-PAGE分離膠和濃縮膠成分Table 2 Composition of separating and stacking gel of SDS-PAGE

1.2.3.6 微觀結(jié)構(gòu) 參考馬力[21]的方法測定。用藥匙挑取酸奶中心的凝塊若干,放在2.5%的戊二醛溶液中,于4 ℃固定10 h。用0.9%的生理鹽水清洗樣品3次,每次10 min,然后用液氮迅速處理樣品后,用錘子輕輕錘擊,使之自然斷裂。采用30%、50%、70%、90%和100%乙醇分別對樣品脫水10 min,再用叔丁醇置換乙醇10 min;將置換后的樣品在-80 ℃預(yù)冷,24 h后迅速轉(zhuǎn)移到凍干機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥10 h(溫度-55 ℃,壓力<0.1 MPa)。采用離子濺射儀鍍鉑金膜,觀察微觀結(jié)構(gòu)并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基變化率

以游離氨濃度為橫坐標(biāo),以340 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光值Y與游離氨濃度X的線性方程:Y=0.0018X+0.0171,R2=0.9972,線性關(guān)系良好,可以用于樣品中游離氨基(亮氨酸)的測定。通過游離氨基變化率公式計(jì)算,得到TG酶、漆酶交聯(lián)酸奶游離氨基變化率見表3,阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶游離氨基變化率見圖1。

由表3可知,經(jīng)TG酶交聯(lián)后,酸奶的游離氨基變化率呈顯著上升的趨勢(p<0.05),當(dāng)TG酶用量為1.8 U/g時(shí),酸奶的游離氨基變化率達(dá)到67.42%,之后再增加TG酶用量,游離氨基變化率無顯著變化(p>0.05);經(jīng)漆酶交聯(lián)后,酸奶的游離氨基變化率呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)漆酶用量為0.3 U/g時(shí),酸奶中的的游離氨基最高,且顯著高于其他用量所得游離氨基變化率(p<0.05)。

表3 不同酶交聯(lián)酸奶游離氨基變化率Table 3 The rate of change of free amino groups of different enzymes crosslinked yogurt

由圖1可知,在確定漆酶最佳使用量后,隨著阿魏酸添加量的增加,酸奶的游離氨基變化率先增大后減小,當(dāng)阿魏酸添加量為4.5 mmol/L,顯著提高了漆酶交聯(lián)酸奶的交聯(lián)程度(p<0.05)。

圖1 阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶游離氨基變化率Fig.1 The rate of change of free amino groups of yoghurt treated with ferulic acid and laccase注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05), 相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05);圖3～圖4同。

酶與蛋白質(zhì)相互作用,增強(qiáng)了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。無論是哪種交聯(lián)方式,交聯(lián)程度越高,形成的酶-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)越強(qiáng),改善了酸奶的性能[22]。TG酶交聯(lián)是共價(jià)交聯(lián),形成的凝膠主要是三維的類固體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),當(dāng)增加TG酶的量,酶與底物作用交聯(lián)程度增加,繼續(xù)增加酶的用量,酶與底物作用達(dá)到飽和,交聯(lián)反應(yīng)難以進(jìn)行[23]。目前,關(guān)于TG酶與牛奶蛋白質(zhì)的作用機(jī)理的研究已有很多報(bào)道。漆酶交聯(lián)是直接氧化交聯(lián)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上的苯環(huán),形成二硫-銅的結(jié)合物。國外學(xué)者[24-25]對漆酶催化乳蛋白進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)漆酶能促使乳蛋白發(fā)生分子間的交聯(lián)反應(yīng)。Wang[10]報(bào)道高劑量的漆酶會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生降解,這可能是導(dǎo)致漆酶交聯(lián)酸奶隨漆酶使用量增加而交聯(lián)程度顯著下降的原因。漆酶與牛奶蛋白質(zhì)的作用機(jī)理較復(fù)雜,具體是如何影響牛奶蛋白質(zhì)的交聯(lián)情況有待進(jìn)一步研究。

2.2 感官評價(jià)

TG酶、漆酶交聯(lián)酸奶感官評價(jià)見表4,阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶感官評價(jià)見圖2。

過量的TG酶會(huì)使酸奶產(chǎn)生苦味,過量的漆酶則造成酸奶凝乳偏軟,且酶使用量過多,成本高。由表4可知,經(jīng)TG酶交聯(lián)后,隨TG酶用量的增加,酸奶的感官得分先增大后減小,添加量為1.2、1.8、2.4和3.0 U/g酸奶的感官評分差異不顯著(p>0.05);經(jīng)漆酶交聯(lián)后,隨漆酶用量的增加,酸奶的感官得分先增大后減小,且添加量為0.3 U/g時(shí)的感官評分顯著高于其他水平(p<0.05)。

表4 不同酶交聯(lián)酸奶感官評價(jià)Table 4 The sensory value of different enzymes crosslinked yogurt

由圖2可知,添加阿魏酸后,能夠顯著改善酸奶的感官(p<0.05),但是過量添加阿魏酸會(huì)顯著降低漆酶交聯(lián)酸奶的感官(p<0.05),主要表現(xiàn)在阿魏酸添加量為6 mmol/L和7.5 mmol/L時(shí),酸奶的質(zhì)地變軟、凝乳性能變差。當(dāng)阿魏酸添加量為4.5 mmol/L時(shí),酸奶的感官品質(zhì)最好。

圖2 阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶感官評價(jià)Fig.2 The sensory value of yoghurt treated with ferulic acid and laccase

2.3 質(zhì)構(gòu)特性

TG酶和漆酶交聯(lián)酸奶的質(zhì)構(gòu)特性見表5和表6,阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶質(zhì)構(gòu)變化見表7。

表5 TG酶交聯(lián)酸奶質(zhì)構(gòu)Table 5 Hardness,gumminess,adhesiveness and cohesiveness of TGase cross-linking yogurt

表6 漆酶交聯(lián)酸奶質(zhì)構(gòu)Table 6 Hardness,gumminess,adhesiveness and cohesiveness of laccase cross-linking yogurt

表7 阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶質(zhì)構(gòu)Table 7 Hardness,gumminess,adhesiveness and cohesiveness of ferulic acid and laccase cross-linking yogurt

由表5可知,隨TG酶添加量的增加,內(nèi)聚性增加不顯著(p>0.05);TG酶添加量≤1.8 U/g,TG酶交聯(lián)酸奶的硬度、膠黏性及粘聚性顯著上升(p<0.05);TG酶添加量>1.8 U/g,酸奶的硬度、膠黏性及粘聚性不同程度降低。

由表6可知,隨漆酶使用量的增加,漆酶交聯(lián)酸奶的硬度、膠黏性、粘聚性和內(nèi)聚性均先增大后減小,且漆酶使用量為0.3 U/g時(shí),硬度、膠黏性和內(nèi)聚性顯著高于其他水平；粘聚性略高于其他水平。綜上所述,TG酶和漆酶均能提高酸奶的硬度、膠黏性和粘聚性。

由表7看出,添加阿魏酸后,隨阿魏酸添加量的增加,漆酶交聯(lián)酸奶的硬度、膠黏性、內(nèi)聚性及粘聚性均先上升后下降,綜合各指標(biāo)結(jié)果,選擇阿魏酸添加量為4.5 mmol/L。

2.4 酶交聯(lián)酸奶表觀黏度

TG酶、漆酶交聯(lián)酸奶表觀黏度見表8,阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶表觀黏度見圖3。

由表8可知,經(jīng)TG酶和漆酶交聯(lián)后,酸奶的表觀黏度均先增大后減小。在酶的催化下,酸奶的表觀黏度增大是由于酶使蛋白質(zhì)交聯(lián)成很大的聚合物,使蛋白質(zhì)的分子量增加,從而增加酸奶的黏度[22];但過度交聯(lián)又使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)過于緊密,抑制其均勻發(fā)展,從而降低了黏度[26]。

表8 不同酶交聯(lián)酸奶表觀黏度Table 8 The apparent viscosity of different enzymes crosslinked yogurt

由圖3看出,在確定漆酶最佳使用量后,隨著阿魏酸添加量的增加,酸奶的表觀黏度呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)阿魏酸添加量為4.5 mmol/L,酸奶表觀黏度最大。阿魏酸的存在使得乳蛋白質(zhì)交聯(lián)程度增加,大分子蛋白質(zhì)增多,黏度增大[27]。

圖3 阿魏酸+漆酶交聯(lián)酸奶表觀黏度Fig.3 The apparent viscosity of yoghurt treated with ferulic acid and laccase

綜合上述游離氨基變化率、感官、質(zhì)構(gòu)及表觀黏度等指標(biāo),選擇酶交聯(lián)酸奶的TG酶和漆酶最佳用量分別為1.8 U/g和0.3 U/g,漆酶交聯(lián)酸奶中,阿魏酸的最佳添加量為4.5 mmol/L。

2.5 酶交聯(lián)酸奶SDS-PAGE

TG酶、漆酶交聯(lián)益生菌酸奶SDS-PAGE圖譜見圖4。乳中的蛋白質(zhì)主要由酪蛋白、乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白等組成,含量為2.8%～3.7%。酪蛋白包括α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)和γ-酪蛋白(γ-CN),其中γ-CN是乳中蛋白酶分解β-CN產(chǎn)生的,實(shí)際上乳中酪蛋白只有前3種類型;酪蛋白分子量在20～40 kDa,主要集中在31 kDa范圍。乳清蛋白包括α-乳白蛋白(α-la)、β-乳球蛋白(β-lg)、血清白蛋白及乳鐵蛋白等,各組分理論分子量分別為14、18、66和76 kDa[28]。由圖4可以看出,所有酸奶樣品的β-lg條帶都消失了,這一現(xiàn)象可能是由于雙歧桿菌對蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致的,具體原因有待進(jìn)一步研究。與對照(泳道3)及漆酶酸奶(泳道5和6)相比,經(jīng)TG酶交聯(lián)后,酸奶(泳道4)不存在κ-CN和β-CN條帶,而是聚集成了新的蛋白質(zhì),分子量在55～68 kDa,與常忠義[29]研究結(jié)論一致,同時(shí)也論證了酪蛋白是TG酶的良好底物[30];與只添加阿魏酸(泳道1)相比,經(jīng)漆酶交聯(lián)后,漆酶酸奶(泳道5)及阿魏酸+漆酶酸奶(泳道6)的蛋白質(zhì)條帶基本沒有發(fā)生變化。但與對照(泳道3)和TG酶酸奶(泳道4)相比,漆酶酸奶(泳道5)及阿魏酸+漆酶酸奶(泳道6)分子量在14 kDa的蛋白條帶明顯變寬,表明在漆酶、阿魏酸作用下,牛乳中一些比α-la更小分子量的蛋白質(zhì)聚集成了新的蛋白質(zhì),新蛋白質(zhì)的分子量在14 kDa附近,這也進(jìn)一步說明漆酶、阿魏酸作用的是小分子乳蛋白。

圖4 不同酶交聯(lián)益生菌酸奶SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of different enzymes crosslinked yogurt注:1:阿魏酸;2:蛋白marker;3:對照;4:TG酶(1.8 U/g); 5:漆酶(0.3 U/g);6:阿魏酸+漆酶(4.5 mmol/L)。

2.6 酶交聯(lián)酸奶微觀結(jié)構(gòu)

對不同酶交聯(lián)益生菌酸奶的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,樣品對應(yīng)的掃描電鏡圖片見圖5,所有樣品的放大倍數(shù)均為8000倍。

圖5 不同酶交聯(lián)益生菌酸奶掃描電鏡圖(8000×)Fig.5 SEM photographs of different enzymes crosslinked yogurt(8000×)注:A:對照;B:TG酶酸奶(1.8 U/g);C:漆酶酸奶(0.3 U/g);D:阿魏酸+漆酶酸奶(4.5 mmol/L)。

由圖5可知,所有酸奶的內(nèi)部都形成了三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),所有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)都是由球形酪蛋白膠束堆砌而成,而由球形酪蛋白膠束形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比較脆弱,是造成酸奶硬度較低的一個(gè)原因[31-32]。有文獻(xiàn)報(bào)道,在酸性乳體系中,體系中粒子間的靜電斥力越強(qiáng)烈,越有利于鏈狀結(jié)構(gòu)的形成,因?yàn)榱Ｗ娱g斥力越強(qiáng)烈,體系內(nèi)部粒子分散得越均勻,粒子越容易有規(guī)律地排列在一起而形成鏈狀結(jié)構(gòu);而鏈狀分支越多,則越有利于膠粒間的交聯(lián)作用,這對于形成穩(wěn)定強(qiáng)有力的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是很有利的[33-34]。

在對照酸奶樣品(A)中,膠粒間空隙較多且較大,空隙的大小分布在0～7 μm,形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較疏松;經(jīng)TG酶、漆酶交聯(lián)的酸奶,三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得致密,膠粒間的空隙變小,結(jié)構(gòu)也變得平滑。相對于漆酶交聯(lián)酸奶(C),TG酶交聯(lián)酸奶(B)的膠粒更大、分布更加均勻,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密。在漆酶交聯(lián)酸奶中添加了阿魏酸后,酸奶(D)的蛋白膠束更加均勻,空隙的數(shù)量也減少。有研究表明,酸奶的微觀結(jié)構(gòu)在很大程度上反映了其持水力、質(zhì)構(gòu)以及流變學(xué)性質(zhì)等[35]。酸奶的掃描電鏡圖進(jìn)一步論證了TG酶和漆酶對酸奶的交聯(lián)程度、質(zhì)構(gòu)及表觀黏度都有改善作用。

3 結(jié)論

通過對比TG酶、漆酶與牛奶蛋白交聯(lián)對雙歧桿菌益生菌酸奶游離氨基變化率、感官、質(zhì)構(gòu)特性及表觀黏度的影響,得到:TG酶和漆酶均能夠明顯提高酸奶的游離氨基含量,改善酸奶的感官、質(zhì)構(gòu)等特性。當(dāng)TG酶、漆酶用量分別為1.8和0.3 U/g時(shí),這兩種酶制備的益生菌酸奶的游離氨基含量、感官、質(zhì)構(gòu)及表觀黏度最好。添加阿魏酸明顯提高了漆酶交聯(lián)酸奶的交聯(lián)程度,阿魏酸的最適添加量為4.5 mmol/L。

在確定了TG酶、漆酶、阿魏酸的最適用量后,通過對酸奶進(jìn)行電泳分析和電鏡掃描,得到:所有雙歧桿菌酸奶樣品均缺少β-lg條帶;與對照及漆酶酸奶相比,TG酶交聯(lián)酸奶κ-CN和β-CN條帶消失,聚集成了新的蛋白質(zhì);相較于對照及TG酶酸奶,漆酶交聯(lián)酸奶及阿魏酸+漆酶酸奶分子量在14 kDa的蛋白條帶明顯變寬。經(jīng)TG酶和漆酶交聯(lián)的酸奶,三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得致密,膠粒間的空隙變小,結(jié)構(gòu)也變得平滑,但TG酶交聯(lián)酸奶的膠粒分布更加均勻,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密;阿魏酸能夠提高漆酶交聯(lián)酸奶的蛋白膠束聚集程度。

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