趙利利,李志田,李彬彬,薛林林,盧士玲,樊慶魯

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000; 2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000)

組胺是毒性最大的生物胺[1],適量的組胺對(duì)人體的各種生理機(jī)能有調(diào)節(jié)作用,而組胺量過高會(huì)導(dǎo)致中毒甚至有生命危險(xiǎn)[2]。中毒癥狀表現(xiàn)為頭痛、心跳呼吸加快、血壓下降等[3]。組胺是游離組氨酸在微生物的組氨酸脫羧酶作用下,發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的[4]。研究發(fā)現(xiàn)許多微生物可以產(chǎn)生組胺[5-6],因此,控制產(chǎn)組胺菌的生長(zhǎng)是減少組胺中毒最有效的方法[7]。在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)、貯藏和銷售過程中均會(huì)有組胺的積累[8-10]。所以在香腸發(fā)酵過程中使用添加劑對(duì)組胺的控制非常重要。

阿魏酸是酚類化合物的一種,存在于水果、糧食、蔬菜、中藥等中。阿魏酸安全低毒,具有一定的抑菌作用[11]。據(jù)報(bào)道,它還具有多種生理功能,對(duì)多種疾病,包括癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)性疾病都有廣泛的治療作用[12]。阿魏酸在日本被正式批準(zhǔn)為食品添加劑,可以加入餅干、熟食,主要用作食品抗氧化劑提高食品質(zhì)量[13]。魏延玲[14]在阿魏酸對(duì)風(fēng)干鱸魚中N-亞硝胺及生物胺的抑制作用的研究中發(fā)現(xiàn)阿魏酸對(duì)組胺有很好的抑制作用,使用阿魏酸能顯著抑制(p<0.05)風(fēng)干鱸魚加工及貯藏過程中微生物的生長(zhǎng)。而關(guān)于阿魏酸能否抑制熏馬腸中組胺的研究還未見報(bào)道。

本研究旨在利用阿魏酸對(duì)熏馬腸中高產(chǎn)組胺的大腸桿菌(Escherichiacoli)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)的作用效果進(jìn)行研究,為阿魏酸應(yīng)用于熏馬腸及其他發(fā)酵香腸提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏酸(純度98%)、組氨酸(純度99%) 北京博奧拓科技有限公司;甲醇、乙腈(均為色譜純) 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;組胺(純度97%)、丹磺酰氯(純度99%)和組氨酸(純度99%) 美國(guó)Sigma公司；NH4OH(純度25%)、乙醇(純度99%)、NaHCO3(純度99%)和NaOH(純度96%) 天津永晟精細(xì)化工有限公司；磷酸吡哆醛(純度99%) 上海瑞永生物科技有限公司；高氯酸(純度72%) 天津政成化學(xué)制品有限公司；丙酮(純度99%) 濟(jì)南源飛偉業(yè)化工有限公司；微生物選擇性培養(yǎng)基:改良后的MSA(NaCl減半)、VRBGA 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;供試菌株(見表1) 前期從熏馬腸樣品中分離。

表1 供試菌株Table 1 Strains used in the experiment

LDZX-40型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀 日本島津公司;ZXRD-7080型全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;EPED-20TJ型實(shí)驗(yàn)室超純水器 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;ZHWY-1111型落地普通型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;DNP-9272型恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏有限公司;KQ-250B型超聲波清洗器 江蘇同君儀器科技有限公司;UB-7型pH計(jì) 美國(guó)賽多利斯丹佛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿魏酸抑菌能力的測(cè)定 將活化好的菌液稀釋為105、106、107CFU/mL,備用。采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法,通過比較添加阿魏酸與未添加阿魏酸菌落數(shù)的差值,確定阿魏酸的抑菌能力。根據(jù)阿魏酸的使用濃度,用相同體積的乙醇溶解后,準(zhǔn)確加入到對(duì)應(yīng)的MSA和VRBGA固體培養(yǎng)基中,滅菌,冷卻至50 ℃左右,倒板,待平板充分凝固后,加入100 μL稀釋到合適的梯度菌懸液進(jìn)行涂布,在37 ℃培養(yǎng)24 h,待菌落總數(shù)不再顯著增加時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)處理取兩個(gè)重復(fù),另設(shè)對(duì)照組(不加阿魏酸只加入一定量的乙醇),結(jié)果取平均值,計(jì)算菌落總數(shù)及抑菌率[15]。

抑菌率(%)=(CK菌落數(shù)-處理組菌落數(shù))/CK菌落數(shù)×100

1.2.2 阿魏酸最低殺菌濃度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC)和最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用雙倍瓊脂稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度。準(zhǔn)備9個(gè)錐形瓶,編號(hào),錐形瓶中先分別加入等量的固體培養(yǎng)基。不同濃度的阿魏酸用乙醇溶解后(濃度以錐形瓶中固體培養(yǎng)基和乙醇的混合液計(jì)),分別加入到相應(yīng)的錐形瓶中。1號(hào)錐形瓶中加入濃度為0.5%的阿魏酸稀釋液,2號(hào)錐形瓶中加入濃度為0.25%的阿魏酸稀釋液,3號(hào)錐形瓶中加入濃度為0.13%的阿魏酸稀釋液，以此類推,8號(hào)錐形瓶中加入濃度為0.0039%的阿魏酸稀釋液,9號(hào)錐形瓶中不加阿魏酸只加入一定量的乙醇(空白對(duì)照組),滅菌后倒板,接種100 μL濃度稀釋為106CFU/mL的菌液。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,以完全沒有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為該阿魏酸的MIC，將完全沒有菌生長(zhǎng)的平板用接種針挑取一部分直徑為5 mm的餅轉(zhuǎn)接至新鮮無菌平板上，培養(yǎng)24 h后若仍不生長(zhǎng)菌，則為MBC[16-17]。

1.2.3 阿魏酸對(duì)待測(cè)菌株生長(zhǎng)的抑制作用 利用MIC濃度研究阿魏酸對(duì)供試菌生長(zhǎng)過程的抑制作用。準(zhǔn)備兩份等量的固體培養(yǎng)基,一份中加入阿魏酸,一份不加阿魏酸做空白對(duì)照組。將活化的菌液分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h間隔時(shí)間內(nèi)接種涂布平板。

1.2.4 pH的測(cè)定 共設(shè)計(jì)四組來測(cè)定pH:不加阿魏酸和組氨酸的空白對(duì)照組(C);加阿魏酸不加組氨酸組(F);不加阿魏酸加組氨酸組(H);加阿魏酸加組氨酸組(FH)。共準(zhǔn)備156個(gè)試管,每組39個(gè)試管。在C組試管中加入4.8 mL液體培養(yǎng)基和200 μL乙醇做空白對(duì)照組;在F組試管中加入4.8 mL液體培養(yǎng)基和200 μL乙醇溶解的濃度為MIC的阿魏酸稀釋液(濃度以試管中的液體培養(yǎng)基和乙醇混合液計(jì));在H組試管中加入4.8 mL含濃度為0.005%磷酸吡哆醛、0.05%組氨酸的液體培養(yǎng)基和200 μL乙醇;在FH組試管中加入4.8 mL含濃度為0.005%磷酸吡哆醛、0.05%組氨酸的液體培養(yǎng)基和200 μL乙醇溶解的濃度為MIC的阿魏酸稀釋液。滅菌后接種菌液。分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h后,取出對(duì)應(yīng)組測(cè)定pH。

1.2.5 HPLC測(cè)定菌液中組胺的含量

1.2.5.1 組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與柱前衍生 準(zhǔn)確稱取組胺10 mg,用0.4 mol/L的高氯酸定容至10 mL容量瓶中,稀釋至最終濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL組胺標(biāo)準(zhǔn)液,加入200 μL 2 moL/L NaOH使之呈堿性,再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖,然后加入2 mL丹磺酰氯溶液(DNS-Cl,10 mg/mL溶于丙酮中),在40 ℃下處于黑暗中反應(yīng)45 min后,加入100 μL NH4OH終止反應(yīng),靜置30 min后,去除未反應(yīng)的殘留Dns-Cl溶液。加入2.4 mL乙腈使終體積為5 mL。衍生處理后用0.22 μm過濾器處理后,上機(jī)分析。

1.2.5.2 樣品的衍生化 取5支試管,每管中分別加入4.8 mL含濃度為0.05%組氨酸和0.005%磷酸吡哆醛的液體培養(yǎng)基,再分別加入200 μL乙醇溶解的阿魏酸稀釋液,阿魏酸濃度分別為0.000、0.016%、0.031%、0.063%、0.130%(濃度以試管中的液體培養(yǎng)基和乙醇混合液計(jì)),滅菌后接種100 μL待測(cè)B.cereus菌液，另取5支試管，做同樣的處理，滅菌后接種100 μL待測(cè)E.coli菌液。滅菌后接種100 μL待測(cè)菌液,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,取菌液1 mL,12000 r/min高速冷凍離心10 min,移取上清液0.5 mL加入0.4 mol/L高氯酸0.5 mL,此后衍生處理方法同1.2.5.1。過膜后置于樣品瓶中,避光4 ℃保藏,一周可用于分析和測(cè)試[18]。

1.2.5.3 色譜條件 色譜柱為Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速0.8 mL/min,流動(dòng)相A為超純水,流動(dòng)相B為乙腈,用0.22 μm濾膜過濾超聲30 min后備用,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,進(jìn)樣體積20 μL,柱溫30 ℃,梯度洗脫程序:0～5 min,A(35%～25%);5.01～24 min,A(25%～0%);25～30 min,A(35%)。

1.2.5.4 線性實(shí)驗(yàn) 取濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照1.2.5.1方法衍生化后上機(jī)分析，測(cè)定組胺的峰面積。

1.2.5.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度為10 μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照1.2.5.1方法衍生化后上機(jī)分析。連續(xù)進(jìn)樣6次。

1.2.5.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試菌液樣品6份，按1.2.5.1方法衍生化后進(jìn)行HPLC分析。

1.2.5.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試菌液樣品，按1.2.5.1方法衍生化后進(jìn)行HPLC分析，24 h內(nèi)每2 h進(jìn)樣一次。

1.2.5.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試菌液樣品9份，添加濃度為10 μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.5.1方法衍生化后進(jìn)行HPLC分析

1.3 數(shù)據(jù)分析

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007統(tǒng)計(jì)抑菌率,Origin 8.5繪圖,dps2005進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸的抑菌能力

不同濃度的阿魏酸對(duì)兩種供試菌株均有不同程度的抑制效果(圖1)。由于待測(cè)菌種的種類不同抑制效果有一定的差異。由圖1可知,隨著阿魏酸濃度的增加,待測(cè)菌株的抑制率也在增加(p<0.05)。當(dāng)阿魏酸的濃度達(dá)到0.06%時(shí),待測(cè)菌種的抑制率最大,B.cereus抑菌率為45.01%,E.coli抑菌率為60.15%。目前對(duì)阿魏酸抑菌機(jī)理的研究相對(duì)較少,其中呂珍等[19]認(rèn)為阿魏酸使質(zhì)膜蛋白含量的升高,H+-ATPase活性的降低,從而通過破壞酒類酒球菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)抑制生長(zhǎng)而達(dá)到抑菌作用,也有研究認(rèn)為阿魏酸通過抑制細(xì)菌N-乙酰轉(zhuǎn)移酶而達(dá)到其抗菌作用。

圖1 阿魏酸對(duì)待測(cè)菌株的抑菌率(IR)Fig.1 Inhibitory ratios(IR)of ferulic acid on microorganisms

2.2 阿魏酸的最低殺菌濃度(MBC)和最低抑菌濃度(MIC)

從表2中見,不同濃度的阿魏酸對(duì)待測(cè)菌種的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。E.coli和B.cereus的MIC分別為0.031%和0.063%,MBC均為0.063%。阿魏酸對(duì)不同菌株的MBC通常等于或者略高于其MIC,E.coli對(duì)阿魏酸的敏感程度較B.cereus相對(duì)較高。在先前的報(bào)道中,阿魏酸已經(jīng)被證實(shí)對(duì)大腸桿菌和葡萄球菌均有一定的抑制作用[20]。高婷婷等[16]研究得到新疆阿魏根醇提物對(duì)葡萄球菌和芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為31.25 mg/mL和3.91 mg/mL,這一數(shù)值與本研究結(jié)果相差數(shù)倍,可能由于新疆阿魏根中阿魏酸的含量較少(平均含量為3.68 μg/mg)[21]。

表2 阿魏酸對(duì)待測(cè)菌種的MIC和MBCTable 2 The MIC and MBC of ferulic acid against the tested microorganisms

2.3 阿魏酸對(duì)待測(cè)菌液生長(zhǎng)抑制作用的測(cè)定

由圖2和圖3可知,培養(yǎng)初期,在阿魏酸的作用下,供試菌的菌數(shù)被控制在一個(gè)恒定的范圍內(nèi),而且在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi),菌數(shù)增長(zhǎng)的幅度不大。添加加阿魏酸和未加阿魏酸的菌液,共同經(jīng)歷著延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期等三個(gè)階段,添加阿魏酸的菌液三個(gè)時(shí)期相比較空白對(duì)照組時(shí)間均延遲。由此可知,阿魏酸并沒有改變微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì),只是減弱了它對(duì)各個(gè)時(shí)期的界限。同時(shí)也可以得到E.coli菌株在第18 h完成對(duì)數(shù)期,而B.cereus菌株在第15 h就完成了對(duì)數(shù)期。通過測(cè)定微生物生長(zhǎng)情況,初步確定阿魏酸對(duì)供試菌的作用方式和抑制效果。由于阿魏酸的抑制作用與其親脂性有關(guān),因此對(duì)不同菌株的抑制程度有所不同。呂珍等[19]在阿魏酸對(duì)酒類酒球菌生長(zhǎng)作用機(jī)理的研究中也發(fā)現(xiàn):3個(gè)菌株在沒有添加阿魏酸的條件下,都表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)特性,添加了阿魏酸之后,3個(gè)菌株的生長(zhǎng)均受到明顯抑制,生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢,需較長(zhǎng)的時(shí)間才能進(jìn)入穩(wěn)定期,但依然表現(xiàn)出了顯著的菌株生長(zhǎng)特性。

圖2 阿魏酸對(duì)E. coli生長(zhǎng)抑制作用Fig.2 The inhibition of ferulic acid against growth of E. coli

圖3 阿魏酸對(duì)B. cereus生長(zhǎng)抑制作用Fig.3 The inhibition of ferulic acid against growth of B. cereus

2.4 阿魏酸對(duì)待測(cè)菌株生長(zhǎng)過程中pH的影響

由圖4和圖5可知,在不含組氨酸底物的VRBG和MSA培養(yǎng)液中分別接種供試菌株(C、F組)pH變化情況,不添加阿魏酸的培養(yǎng)液中供試菌(C組)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,菌數(shù)達(dá)到最大值,導(dǎo)致pH迅速下降。E.coli(圖4)和B.cereus(圖5)分別在18 h和15 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期,菌數(shù)增長(zhǎng)緩慢,pH也隨之緩慢下降,最終pH分別在5.47和7.20左右。圖中C、F曲線變化差別較大,添加阿魏酸培養(yǎng)液的pH趨于穩(wěn)定后要高于未添加的C組,說明阿魏酸對(duì)供試菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。在36 h連續(xù)培養(yǎng)過程中,在含組氨酸底物的VRBG和MSA培養(yǎng)液中接種供試菌株(H、FH組)pH均呈現(xiàn)對(duì)數(shù)期前逐漸下降,對(duì)數(shù)期后逐步上升的趨勢(shì);這是由于在本研究中體系的pH主要受供試菌產(chǎn)生的組胺影響,隨著供試菌菌數(shù)的不斷增加,組胺的含量也在不斷累積,而組胺是一類堿性物質(zhì),會(huì)中和供試菌生長(zhǎng)過程中所產(chǎn)的酸。在含組氨酸底物的VRBG和MSA培養(yǎng)液的H組,供試菌株在對(duì)數(shù)期后的pH上升速率最快,隨后分別保持在7.01和7.62左右,由此可以得出,兩株菌都具有較強(qiáng)的產(chǎn)組胺能力,在菌株生長(zhǎng)過程中由于組胺的大量產(chǎn)生,導(dǎo)致了pH的快速上升。而在含組氨酸底物的VRBG和MSA培養(yǎng)液基礎(chǔ)上添加阿魏酸的FH組,pH也具有上升趨勢(shì),但與H組相比差異性非常顯著,說明阿魏酸雖然抑制了供試菌株的生長(zhǎng),但并未將供試菌株殺死。對(duì)比圖4和圖5可發(fā)現(xiàn),阿魏酸對(duì)E.coli的生長(zhǎng)抑制程度較強(qiáng),從而減弱了其產(chǎn)生組胺的能力。C、F組中pH的這種變化趨勢(shì)與呂珍等[19]的研究結(jié)果相似,隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行,3株菌對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的pH均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。四組中pH的這種變化趨勢(shì)與張雅晴等[22]在大蒜精油對(duì)屎腸球菌和糞腸球菌產(chǎn)苯乙胺和酪胺的影響的研究結(jié)果也相似,在含組氨酸底物的培養(yǎng)液中,由于生物胺的產(chǎn)生,導(dǎo)致pH在對(duì)數(shù)期后迅速上升并趨于穩(wěn)定。

圖4 阿魏酸對(duì)E. coli生長(zhǎng)過程中pH的變化Fig.4 The pH change of ferulic acid against E. coli in the process of growth注:C-在VRBG培養(yǎng)基中接種E. coli菌懸液;F-在含有阿魏酸的VRBG培養(yǎng)基中接種E. coli菌懸液;H-在含有組氨酸底物的VRBG培養(yǎng)基中接種E. coli菌懸液;FH-在含有組氨酸底物和阿魏酸的VRBG培養(yǎng)基中接種E. coli菌懸液。

圖5 阿魏酸對(duì)B. cereus生長(zhǎng)過程中pH的變化Fig.5 The pH change of ferulic acid against B. cereus in the process of growth注:C-在MSA培養(yǎng)基中接種B. cereus菌懸液;F-在含有阿魏酸的MSA培養(yǎng)基中接種B. cereus菌懸液;H-在含有組氨酸底物的MSA培養(yǎng)基中接種B. cereus菌懸液;FH-在含有組氨酸底物和阿魏酸的MSA培養(yǎng)基中接種B. cereus菌懸液。

2.5 HPLC測(cè)定阿魏酸對(duì)待測(cè)菌株作用后組胺含量

2.5.1 線性實(shí)驗(yàn) 以不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=53433X+67201，R2=0.9996。結(jié)果表明，組胺線性關(guān)系良好，可用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 按照1.2.5.5實(shí)驗(yàn)方法操作，得到組胺對(duì)應(yīng)的峰面積RSD值為0.21%，精密度符合檢測(cè)要求。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照1.2.5.6實(shí)驗(yàn)方法操作，得到組胺對(duì)應(yīng)的峰面積RSD值為5.36%，該方法的重復(fù)性良好，符合要求。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照1.2.5.7實(shí)驗(yàn)方法操作，得到組胺對(duì)應(yīng)的峰面積RSD值為1.32%，表明供試菌液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 按照1.2.5.8實(shí)驗(yàn)方法操作，結(jié)果表明，組胺平均回收率97.35%，對(duì)應(yīng)的峰面積RSD值為3.41%，可見該方法可滿足組胺檢測(cè)的需要。

2.5.6 樣品溶液中組胺的色譜分離圖 參照1.2.5.2方法進(jìn)行HPLC分析。選取其中添加0.000%和添加0.063%阿魏酸后B.cereus溶液中組胺的色譜圖來進(jìn)行對(duì)比，記錄色譜圖6。從圖中可以看出溶液中組胺的色譜分離度及峰形均良好，組胺的保留時(shí)間為12.24 min，與未添加阿魏酸的B.cereus培養(yǎng)液相比(圖6a)，添加0.063%阿魏酸后B.cereus溶液中(圖6b)組胺的峰高明顯變低，說明阿魏酸對(duì)減少B.cereus樣品溶液中組胺的含量具有很好的抑制效果。

圖6 組胺樣品圖譜Fig.6 HPLC chromatographic profiles of histamine content注:a-未添加阿魏酸的組胺樣品圖譜; b-添加0.063%阿魏酸后的組胺樣品圖譜。

2.5.7 阿魏酸對(duì)組胺的抑制作用 由圖7可知,添加不同濃度的阿魏酸對(duì)減少供試菌中的組胺的含量具有顯著性效果(p<0.05),當(dāng)添加0.13%阿魏酸時(shí),E.coli中組胺的最低生成量能達(dá)到88.12 μg/mL,較空白對(duì)照組減少了37.94%,B.cereus中組胺的最低生成量達(dá)到79.13 μg/mL,相對(duì)于空白對(duì)照組減少了38.18%。當(dāng)阿魏酸的添加量在為最低抑菌濃度時(shí),E.coli中組胺的生成量能達(dá)到115.87 μg/mL,較空白對(duì)照組減少了18.45%,B.cereus中組胺的最低生成量達(dá)到95.94 μg/mL,相對(duì)于空白對(duì)照組減少了25.78%。楊健等[23]從鰹魚內(nèi)臟中分離得到兩株產(chǎn)組胺蠟狀芽孢桿菌,徐賽男[24]從浙東特色腌冬瓜中定向篩選得到的產(chǎn)組胺菌為腸桿菌屬中的Enterobacteraerogenes和Enterobacterxiangfangensis,與本實(shí)驗(yàn)研究的兩株產(chǎn)組胺菌株相似。研究表明,天然植物提取物能夠抑制組胺的形成。Luyun Cai[25]研究發(fā)現(xiàn)紅魚片的空白組中組胺含量為(19.41±1.63) mg/kg,在添加丁香、孜然和綠薄荷后組胺含量分別降低了(2.66±0.27) mg/kg,(1.84±0.09) mg/kg和(1.27±0.24) mg/kg。楊蓉蓉等[26]研究發(fā)現(xiàn)在風(fēng)干鱸魚加工及貯藏過程中組胺含量呈上升趨勢(shì),隨著八角茴香提取物添加量的增加,組胺含量顯著(p<0.05)降低。王永麗等[27]就姜辣素對(duì)培根加工和成熟階段的微生物數(shù)量變化及生物胺的形成影響作出研究,證實(shí)了其在組胺的累積方面具有一定的抑制效果。盧士玲等[28]在發(fā)酵劑和植物提取物對(duì)傳統(tǒng)中式熏馬腸中生物胺積累的影響研究中發(fā)現(xiàn)植物取物能明顯減少(p<0.05)熏馬腸中的組胺量。

圖7 添加阿魏酸后菌株的產(chǎn)組胺量Fig.7 Changes of histamine contents affected by addition of ferulic acid注:同種微生物不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

阿魏酸對(duì)兩株待測(cè)菌液均有抑制作用,抑制率隨著阿魏酸濃度的增大而增大。阿魏酸對(duì)E.coli和B.cereus的MIC分別為0.031%和0.063%。當(dāng)阿魏酸的添加量為MIC時(shí),沒有影響產(chǎn)組胺菌株的三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的變化,僅僅減弱了菌株三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的界限,不添加阿魏酸的培養(yǎng)液中供試菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,菌數(shù)達(dá)到最大值。在含阿魏酸和組氨酸底物的培養(yǎng)液中接種供試菌株pH均呈現(xiàn)對(duì)數(shù)期前逐漸下降,對(duì)數(shù)期后逐步上升的趨勢(shì)。阿魏酸能夠影響供試菌生長(zhǎng)過程中pH的變化,抑制了供試菌組氨酸脫羧酶的活性,從而減弱了其產(chǎn)生組胺的能力。當(dāng)阿魏酸的添加量在最低抑菌濃度時(shí),E.coli中組胺的生成量較空白對(duì)照組減少了18.45%,B.cereus中組胺的生成量相對(duì)于空白對(duì)照組減少了25.78%,對(duì)供試菌組胺的產(chǎn)生抑制效果顯著(p<0.05)。

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