王嘉琪,呂銘守,凃 婧,王 冰,楊 楊,張 娜,石彥國

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

建水豆腐是云南省特色的傳統(tǒng)食品,歷史悠久,早在清代中后期就享有盛名,建水豆腐制作的獨(dú)特之處在于用酸漿代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鹽鹵和石膏做凝固劑。酸漿是制作豆腐產(chǎn)生的黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵“變酸”形成的,并可循環(huán)利用,原料均來自豆腐本身,是綠色、安全的。酸漿點(diǎn)制的豆腐口感細(xì)膩、保水性好、味道甘甜、無苦澀味,深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1-3]。酸漿作為凝固劑使大豆蛋白凝固的機(jī)理為酸凝[4],其產(chǎn)酸的微生物主要為乳酸菌[5]。酸漿豆腐延續(xù)小作坊，依靠人們多年經(jīng)驗(yàn)的制作,風(fēng)味獨(dú)特。因此,從云南建水酸漿豆腐生產(chǎn)用酸漿出主要的微生物,選育具有優(yōu)良性狀的乳酸菌可以豐富微生物資源,并推動(dòng)酸漿豆腐工業(yè)化發(fā)展。

乳酸菌的應(yīng)用非常廣泛,已經(jīng)被公認(rèn)為安全綠色的食品添加劑[6],不僅對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)和腸道健康起著關(guān)鍵作用,某些乳酸菌甚至具有治療胃腸道疾病[7-8]、降低“三高”[9-10]、提高免疫力[11-12]、緩解精神疾病[13-14]等益生功能。乳酸菌在發(fā)酵黃漿水的過程中產(chǎn)生大量的乳酸,降低黃漿水的pH,使酸漿的pH降低至3.5～4.0[1],乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸性環(huán)境使其它雜菌難以存活,所以篩選出具有產(chǎn)酸速度快、耐酸能力強(qiáng)的乳酸菌對(duì)酸漿的生產(chǎn)效率和質(zhì)量非常重要。酸漿豆腐的制作過程中乳酸菌由酸漿到豆腐中,其生存環(huán)境發(fā)生了變化,所以具有一定的耐滲透壓能力的乳酸菌會(huì)增加其在豆腐中的存活率,進(jìn)而使其繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味。

本研究從云南建水制作酸漿豆腐所用酸漿中分離出五株乳酸菌,對(duì)其生長特性、產(chǎn)酸速率、耐酸能力、耐滲透壓能力進(jìn)行比較研究,以期為酸漿工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支撐,并對(duì)酸漿豆腐工業(yè)化生產(chǎn)提供前提保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SYG01為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis),SYG02為棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis),SYG03為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus),SYG04為融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa),SYG05為Lactobacillusconcavus來源于哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室,分離自云南建水酸漿豆腐生產(chǎn)用酸漿;鹽酸、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀 均為分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

HD580型潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;DHP-9162B型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;移液槍 蘇州艾利弗電氣有限公司;PHS-3C可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長曲線測(cè)定 將預(yù)先活化好的五株乳酸菌按5%的接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,每隔2 h取發(fā)酵液,以未接菌MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照,在600 nm波長處測(cè)定其吸光值(OD600 nm),平行測(cè)定3次,繪制五株乳酸菌菌的生長曲線。

1.2.2 產(chǎn)酸能力測(cè)定 將預(yù)先活化好的乳酸菌按5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,每隔6 h測(cè)定發(fā)酵液的pH及產(chǎn)總酸量,平行測(cè)定3次。

產(chǎn)酸量的測(cè)定:取5.00 mL發(fā)酵液放入250 mL的錐形瓶中用去CO2水適當(dāng)稀釋,加入5滴0.1%酚酞指示液,搖勻,用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定的0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色,30 s內(nèi)不褪色,記錄氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量,按如下公式計(jì)算產(chǎn)總酸量。

式中:C2為產(chǎn)酸量,g/L;C1為NaOH溶液濃度,mol/L;M為乳酸摩爾質(zhì)量，g/mol;F為試液稀釋倍數(shù);V1為NaOH滴定發(fā)酵液消耗的體積,mL;V2為NaOH滴定空白對(duì)照消耗的體積,mL;V3為待測(cè)發(fā)酵液體積,mL。

1.2.3 耐酸能力測(cè)定 將預(yù)先活化好的乳酸菌按5%的接種量分別接種于初始pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的MRS液體培養(yǎng)基中,以pH6.2的自然MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),平行測(cè)定3次。

活菌計(jì)數(shù):采用平板計(jì)數(shù)法,將培養(yǎng)好的菌液用無菌生理鹽水逐級(jí)稀釋,分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7混勻,吸取100 μL 樣品勻液于無菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿,及時(shí)將15～20 mL冷卻至46 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),37 ℃培養(yǎng) 48 h。選取菌落數(shù)30～300 CFU為有效計(jì)數(shù)平皿,進(jìn)行計(jì)數(shù)。依照下式計(jì)算出菌體濃度(CFU/mL):

菌體濃度(CFU/mL)=(C÷V)×M

式中:C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù),V代表涂平板時(shí)所用稀釋液的體積,M代表稀釋倍數(shù)。

1.2.4 耐滲透壓能力測(cè)定 將預(yù)先活化好的乳酸菌按5%的接種量分別接種于NaCl濃度為0%、2%、4%、6%、8%、10%的液體MRS培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),平行測(cè)定3次。

1.2.5 單菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸能力比較 將預(yù)先活化好的乳酸菌按2%的接種量分別單獨(dú)接種于滅菌的黃漿水(105 ℃高壓滅菌15 min)中進(jìn)行發(fā)酵,每隔6 h測(cè)其發(fā)酵液pH,后期發(fā)酵液pH變化不顯著時(shí)可延長12 h測(cè)其pH,平行測(cè)定3次。

1.2.6 雙菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸能力比較 分別按菌株SYG02∶SYG01、SYG02∶SYG03、SYG02∶SYG04、SYG02∶SYG05均為1∶1的比例混合,按2%的接菌量接種于滅菌的黃漿水(105 ℃高壓滅菌15 min)中進(jìn)行發(fā)酵,每隔6 h測(cè)其發(fā)酵液pH,后期發(fā)酵液pH變化不顯著時(shí)可延長12 h測(cè)其pH,平行測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能比較

由圖1可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,五株菌的生長趨勢(shì)相似。0～6 h五株菌株均處于遲緩期,6～20 h菌株SYG02、SYG04和SYG05呈對(duì)數(shù)生長期,菌株SYG01和SYG03分別在6～18 h和6～26 h呈對(duì)數(shù)生長期,其繁殖速率最快。菌株SYG02和SYG05、SYG03和SYG04、SYG01分別在20～44 h、18～36 h、26～42 h為穩(wěn)定期,菌體濃度變化趨于平穩(wěn)。在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),其中菌株SYG02的菌體濃度最大、繁殖能力最強(qiáng),其次是菌株SYG03,而菌株SYG05、SYG04、SYG01的生長速率明顯較慢。

圖1 五株乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of five strains

2.2 產(chǎn)酸能力比較

酸漿發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸一方面可以有效的降低酸漿的pH,從而抑制霉菌和細(xì)菌的生長,另一方面有機(jī)酸對(duì)酸漿的風(fēng)味物質(zhì)形成及酸漿豆腐的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)有重要的作用。分別對(duì)五株乳酸菌產(chǎn)酸性能進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 五株乳酸菌發(fā)酵液pH變化Fig.2 Different pH of medium during fermentation of three strains

圖3 五株乳酸菌的產(chǎn)酸能力Fig.3 Lactic acid production capacity of five strains

由圖2可以看出,菌株SYG01培養(yǎng)液的pH下降最緩慢,最終pH為4.70,菌株SYG02、SYG03、SYG05、SYG04培養(yǎng)液的pH在0～24 h內(nèi)迅速下降,隨之緩慢降低直至趨于平穩(wěn),最終pH分別達(dá)到3.52、3.76、3.83、3.98。由圖3可以看出,五株菌株的產(chǎn)酸量在0～18 h迅速增加,隨后菌株SYG02和SYG03呈緩慢增加的趨勢(shì),而菌株SYG05、SYG04、SYG01的產(chǎn)酸量基本變化不大,這可能是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,培養(yǎng)液的pH逐漸降低,在較低的pH環(huán)境下使乳酸菌的生長受到抑制甚至死亡,而菌株SYG02和SYG03的耐酸能力強(qiáng)于其它三株菌株,所以18 h以后的產(chǎn)酸量高于其它三株菌株。在五株菌株中SYG02產(chǎn)酸速度最快,最終乳酸濃度為60.75 g/L,菌株SYG03的產(chǎn)酸速度僅次于SYG02,最終乳酸濃度為53.46 g/L,菌株SYG05、SYG04、SYG01次之。由圖2、圖3可得出,菌株SYG02和SYG03的產(chǎn)酸能力明顯高于其它三株菌株。

2.3 耐酸能力比較

制作酸漿豆腐所用的酸漿pH為3.5～4.0[3],乳酸菌應(yīng)具有一定的耐酸能力才能保證酸漿發(fā)酵的順利進(jìn)行。由圖4可知,五株乳酸菌的生長均隨pH的降低而減小,但減小幅度不同,同一菌株在不同pH環(huán)境下也表現(xiàn)出了不同的生存能力,表明各菌株對(duì)酸的耐受能力不同(各菌株的初始活菌數(shù)在1.5×109～2.7×109CFU/mL)。菌株SYG01耐酸能力最弱,在pH3.5、3.0時(shí)培養(yǎng)24 h活菌數(shù)遠(yuǎn)小于pH6.2,這可能是由于pH過低的環(huán)境導(dǎo)致乳酸菌無法維持自身細(xì)胞內(nèi)的pH穩(wěn)定,從而導(dǎo)致生長受到抑制,甚至部分死亡。菌株SYG04和SYG05在pH大于4.0的環(huán)境中可以良好生長,當(dāng)pH降至3.5時(shí),培養(yǎng)24 h后菌體濃度下降迅速,當(dāng)pH3.0時(shí)活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)僅為102CFU/mL。對(duì)于菌株SYG02和SYG03而言,在pH3.5和pH3.0條件下,培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)達(dá)到105CFU/mL和104CFU/mL以上,活菌數(shù)均高于其它三株菌株,故菌株SYG02和SYG03具有較好的耐酸能力。

圖4 五株乳酸菌對(duì)不同pH的耐受力Fig.4 Tolerance of five strains to different pH values

2.4 耐滲透壓能力比較

不同的微生物對(duì)滲透壓的抵抗力有所不同,但是任何一種微生物對(duì)滲透壓的抵抗力都有一定的限度,超過一定的滲透壓,微生物的生長會(huì)受到抑制甚至死亡[15]。如圖5可知,五株乳酸菌在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl下表現(xiàn)出了各不相同的耐受能力。菌株SYG01和SYG04的耐滲透壓能力最弱,在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、8%時(shí),培養(yǎng)24 h活菌數(shù)遠(yuǎn)小于不含NaCl培養(yǎng)基內(nèi)的活菌數(shù),說明其生長受到抑制,當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大至10%時(shí),菌株SYG01和SYG04基本不能生產(chǎn)而死亡。菌株 SYG03和SYG05在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為在6%生長良好,培養(yǎng)24 h后,活菌數(shù)在106CFU/mL以上,當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于6%時(shí)生長受到明顯抑制。而菌株SYG02在所有NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下均表現(xiàn)出良好的生存能力,培養(yǎng)24 h后,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%和10%時(shí)活菌數(shù)分別達(dá)到107CFU/mL和105CFU/mL以上。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大時(shí),相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下菌株SYG02比其余四株表現(xiàn)出較好的耐受性,因此菌株SYG02的耐滲透壓能力最佳。

2.5 單菌發(fā)酵黃漿水及雙菌混合發(fā)酵黃漿水比較

由圖6可知,在單菌種發(fā)酵模式下五株乳酸菌均可發(fā)酵豆腐黃漿水產(chǎn)酸,五株乳酸菌在發(fā)酵豆腐黃漿水初期的24 h內(nèi),菌株處于對(duì)數(shù)生長期,產(chǎn)酸能力強(qiáng),pH下降快,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,產(chǎn)酸速率有所下降,48 h后產(chǎn)酸量趨于平穩(wěn);菌株SYG02產(chǎn)酸能力最強(qiáng),產(chǎn)酸量一直處于上升的趨勢(shì),在發(fā)酵72 h后黃漿水的pH為3.66,產(chǎn)酸量達(dá)到5.2 g/L。由此可見,這五株乳酸菌在沒有補(bǔ)充任何營養(yǎng)成分前提下,能夠在黃漿水中迅速生長產(chǎn)酸,其中菌株SYG02效果最好，具有很好的應(yīng)用前景。

圖6 單菌發(fā)酵黃漿水pH和產(chǎn)酸量的變化Fig.6 Changes of pH and acid production for yellow serofluid fermented by single lactobacillu

由圖7與圖6對(duì)比可以看出,菌株SYG02與其它四株菌株復(fù)配發(fā)酵豆腐黃漿水的效果要優(yōu)于各菌株單獨(dú)發(fā)酵,這可能是由于五株菌株均分離自云南建水酸漿豆腐生產(chǎn)所用的酸漿,在經(jīng)過長期的自然馴化過程中,自然酸漿中已經(jīng)形成了共生乳酸菌群,雙菌混合的共生作用促進(jìn)其生長,進(jìn)而使其產(chǎn)酸效果增強(qiáng),其中菌株SYG02和菌株SYG03組合發(fā)酵的效果最好,在發(fā)酵72 h后黃漿水的pH為3.52,產(chǎn)酸量達(dá)到6.46 g/L。

圖7 雙菌發(fā)酵黃漿水pH和產(chǎn)酸量的變化Fig.7 Changes of pH and acid production for yellow serofluid fermented by double lactobacillus

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)五株乳酸菌的生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸能力、耐滲透壓能力進(jìn)行比較研究,結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),菌株SYG02繁殖能力最強(qiáng)；在產(chǎn)酸能力方面,菌株SYG02產(chǎn)酸能力最強(qiáng),速度最快，培養(yǎng)至24 h時(shí)其pH降低至3.73,42 h時(shí)其pH低至3.52；在耐酸能力方面,菌株SYG02和SYG03具有較好的耐酸能力；在耐滲透壓方面,SYG02在8%(w/v)的NaCl中依然表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性,活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)達(dá)到107CFU/mL,其余4株菌在NaCl含量大于6%(w/v)時(shí)生長受到明顯抑制。通過對(duì)五株乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵黃漿的研究,結(jié)果表明五株乳酸菌均可在黃漿水中生長產(chǎn)酸,使發(fā)酵液的pH降低,對(duì)于酸漿來說pH的下降可抑制其它微生物的生長,對(duì)酸漿的安全性具有重要意義。在對(duì)雙菌發(fā)酵黃漿水與單菌發(fā)酵黃漿水的比較研究中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙菌發(fā)酵的效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵,其中菌株SYG02和菌株SYG03組合發(fā)酵的效果最好。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)云南建水酸漿豆腐生產(chǎn)所用酸漿中的乳酸菌能夠發(fā)酵豆腐黃漿水制作酸漿,因此我們可以進(jìn)一步充分利用這些乳酸菌發(fā)酵制作豆腐。張影等[16]用豆腐黃漿水發(fā)酵制備酸漿凝固劑,所得酸漿豆腐感官性能和力學(xué)性能均優(yōu)于市售鹵水豆腐;喬之紅等[17-18]將不同的乳酸菌混合發(fā)酵制得布丁豆腐,改善了以往鹽鹵和石膏豆腐的苦澀味。這為我們利用酸漿中的乳酸菌提供了依據(jù),我們可以應(yīng)用其制作酸漿豆腐,既可以保留建水豆腐的特殊風(fēng)味,又可以改善豆腐的質(zhì)地,去除鹽鹵和石膏豆腐的苦澀味。在優(yōu)化豆腐生產(chǎn)工藝的同時(shí),又使得黃漿水得以循環(huán)利用。

[1]喬支紅,閆佳,陳虹,等. 酸漿標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015(12):162-164,169.

[2]于章龍,劉楚怡,李永歌,等. 酸漿豆腐中菌種抗高溫?fù)p傷保護(hù)劑的研究[J]. 食品科技,2010,35(7):5-8.

[3]葉青,許云賀,張莉力. 利用干酪乳桿菌YQ336制備酸漿豆腐凝固劑的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2017,38(14):106-110,115.

[4]宋俊梅,曲靜然,李燕,等. 脆豆腐老漿液點(diǎn)漿機(jī)理的研究[J]. 食品科技,2002(4):14-15.

[5]孟克畢力格,陳平,王鋰韞,等. 一種豆腐凝固劑酸湯中乳酸菌的分離及其生物學(xué)特性的研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2000,21(3):89-93.

[6]Schrezenmeir J,De V M. Probiotics,prebiotics,and synbiotics-approaching a definition[J]. American Journal of Clinical Nutrition,2001,73(2):361s-364s.

[7]Saez-Lara M J,Gomez-Llorente C,Plaza-Diaz J,et al. The role of probioticLacticacid bacteria andBifidobacteriain the prevention and treatment of inflammatory bowel disease and other related diseases:a systematic review of randomized human clinical trials[J]. Biomed Research International,2015,2015:1-15.

[8]崔燕麗,徐曉芬,吳正鈞,等. 乳酸菌胞外多糖對(duì)人類腸道菌群的影響[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志,2016,28(7):851-856.

[9]Hulston C J,Churnside A A,Venables M C. Probiotic supplementation prevents high-fat,overfeeding-induced insulin resistance in human subjects[J]. British Journal of Nutrition,2015,113(4):596-602.

[10]呂秀紅,陳凱飛,朱祺,等. 降膽固醇乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2016,16(3):198-204.

[11]Fong F L Y,Shah N P,Kirjavainen P,et al. Mechanism of action of probiotic bacteria on intestinal and systemic immunities and antigen-presenting cells[J]. International Reviews of Immunology,2016,35(3):179.

[12]Bastani P,Homayouni A,Norouzi-Panahi L,et al. The mechanisms of immune system regulation by probiotics in immune-related diseases[J]. Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences,2016,6(3):105-111.

[13]P?rtty A,Kalliom?ki M,Wacklin P,et al. A possible link between early probiotic intervention and the risk of neuropsychiatric disorders later in childhood:A randomized trial[J]. Pediatric Research,2015,77(6):823-828.

[14]駱鵬飛,俞蘭秀,鐘霞,等. 乳酸菌對(duì)精神性疾病作用的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2017,38(16):347-351.

[15]熊濤,宋蘇華,黃錦卿,等. 植物乳桿菌NCU116在模擬人體消化環(huán)境中的耐受力[J]. 食品科學(xué),2011,32(11):114-117.

[16]張影,劉志明,劉衛(wèi),等. 酸漿豆腐的工藝研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2014(4):21-23,26.

[17]劉恩岐,喬支紅. 發(fā)酵布丁豆腐生產(chǎn)工藝的研究[J]. 食品科學(xué),2006(6):128-130.

[18]喬支紅. 乳酸菌發(fā)酵布丁豆腐生產(chǎn)工藝及其品質(zhì)的研究[D]. 晉中:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.