劉黎瑩,許云賀,葉 青,張莉力,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001; 2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001)

酸漿是將甘薯或綠豆磨碎成淀粉乳后放置一段時(shí)間,經(jīng)微生物自然發(fā)酵,形成的一種淡黃色或乳白色的液體[1]。在綠豆淀粉或甘薯淀粉生成過(guò)程中兌入酸漿,淀粉顆粒會(huì)迅速凝集變大,形成大的絮凝團(tuán),迅速沉降下來(lái)。所以,酸漿實(shí)際上發(fā)揮了絮凝劑的作用,加速綠豆或甘薯淀粉的沉降,使之與蛋白質(zhì)、纖維等雜質(zhì)的快速分離。但是,由于酸漿是自然發(fā)酵的產(chǎn)物,酸漿質(zhì)量受自然環(huán)境、人為因素等影響大,造成酸漿的絮凝活性非常不穩(wěn)定[2-3],使得有時(shí)出現(xiàn)淀粉不能快速沉淀,或者生產(chǎn)出來(lái)的淀粉發(fā)暗、發(fā)酸等現(xiàn)象,生產(chǎn)出的淀粉的質(zhì)量不穩(wěn)定。這些原因?qū)е铝怂釢{法生產(chǎn)淀粉的規(guī)模小,生產(chǎn)的淀粉品質(zhì)不穩(wěn)定,且難以進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

已有研究表明,正是酸漿中的微生物發(fā)揮了促淀粉絮凝的作用[4-7]。劉文菊等[8]研究了綠豆酸漿絮凝淀粉的作用機(jī)理并對(duì)利用酸漿法提取的淀粉性質(zhì)進(jìn)行研究,同時(shí)研究了用海藻酸鈉凝膠包埋乳酸乳球菌沉淀綠豆淀粉的工藝;張莉力等[7，9-10]從甘薯酸漿中分離出13株乳酸菌菌株,篩選出2株具有沉淀淀粉能力的乳酸菌[8-10]。

本研究以自然發(fā)酵綠豆酸漿為研究對(duì)象,利用平板分離法對(duì)酸漿中的微生物進(jìn)行分離,并以絮凝活性為指標(biāo),篩選出一株生長(zhǎng)穩(wěn)定對(duì)綠豆淀粉有高絮凝活性的菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化,為酸漿法在綠豆淀粉生產(chǎn)工業(yè)中的規(guī)?；瘧?yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發(fā)酵綠豆酸漿 錦州醫(yī)科大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室自然發(fā)酵獲得;綠豆 市售食用級(jí);綠豆淀粉 衡水福橋淀粉有限公司;H2O2、H2S、蔗糖、葡萄糖、乳糖、K2HPO4、醋酸鈉、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、尿素、硫酸銨、氯化銨 均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;酵母膏、牛肉膏、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、AP-MN-BT-GDNA-50 Axygen;DNA凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNAmarker 上海桑尼生物科技有限公司。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司;LRH-350F生化培養(yǎng)箱 上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HZQ-F200型振蕩培養(yǎng)箱 上海華鄰實(shí)業(yè)有限公司;TG16K-II臺(tái)式高速離心機(jī) 濟(jì)南福的機(jī)械有限公司;PHS-3B精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;UV754PC紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀表有限公司;OLYMPUS BX53顯微鏡 奧林巴斯(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 綠豆水的制備:取100 g綠豆加蒸餾水至1000 mL,加熱煮沸20 min,用120目的篩子過(guò)濾,即得1000 mL的綠豆水。

綠豆汁培養(yǎng)基:酵母膏5 g、K2HPO42 g、葡萄糖20 g、乳糖2 g、醋酸鈉5 g、綠豆水1000 mL,調(diào)pH至6.8,115 ℃滅菌30 min。

固體綠豆汁培養(yǎng)基:在綠豆汁培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,加入20 g瓊脂,加熱溶解后,115 ℃滅菌30 min。

綠豆汁斜面培養(yǎng)基:將加入20 g瓊脂的綠豆汁培養(yǎng)基加熱溶解后,取3 mL左右加入到試管中,115 ℃滅菌30 min后,取出,趁熱傾斜一定角度擺放在操作臺(tái)上冷卻。

種子培養(yǎng)液:酵母膏0.5 g、K2HPO40.2 g、葡萄糖2 g、乳糖0.2 g、醋酸鈉0.5 g、綠豆水100 mL,調(diào)pH至6.8,分裝到試管和三角瓶中,115 ℃滅菌30 min。從斜面上挑取一環(huán)菌中接種到試管中,30 ℃培養(yǎng)24 h。然后按10%的接種量接種到三角瓶中,30 ℃培養(yǎng)48 h后,按上述步驟將綠豆汁培養(yǎng)液接種到另一個(gè)三角瓶中,30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 菌株的分離與篩選 用無(wú)菌生理鹽水將自然發(fā)酵的綠豆酸漿進(jìn)行10倍梯度稀釋,取10-5、10-6、10-7稀釋度的稀釋液各1 mL,分別注入至無(wú)菌綠豆汁固體培養(yǎng)基中,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)。待培養(yǎng)基凝固后,倒置于30 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。挑取平板上的單菌落劃線接種于固體綠豆汁培養(yǎng)基平板中,30 ℃培養(yǎng)24 h,反復(fù)純化3代。選取平板上表面光滑有光澤低凸邊緣擴(kuò)展整齊的單個(gè)小菌落20株對(duì)其進(jìn)行鏡檢,挑選出10株純度高、雜菌少、桿狀或球狀的菌落。再將挑選出的菌落接種到綠豆汁培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h,然后分別測(cè)定綠豆汁培養(yǎng)液的絮凝率。選出5株對(duì)綠豆淀粉有沉降作用的菌株接種于綠豆汁培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h后,測(cè)定5株菌的絮凝率,挑選出絮凝率最高的。

1.2.3 綠豆淀粉沉降速度(絮凝率)的檢測(cè)方法 在25 mL刻度試管中加入25 mL 2.5%的綠豆淀粉乳溶液之后,加2.5 mL空白綠豆汁培養(yǎng)基溶液,在密封情況下上下?lián)u動(dòng),混勻10次,沉淀3 min,取刻度試管的20 cm處溶液為樣品,測(cè)定600 nm處吸光值計(jì)為A;同樣方法在25 mL刻度試管中加入25 mL 2.5%的綠豆淀粉乳溶液之后加入2.5 mL菌液,密封情況下上下?lián)u動(dòng),混勻10次,沉淀3 min取刻度試管的20 cm處溶液為樣品,測(cè)定600 nm處吸光值計(jì)為B。絮凝率的計(jì)算公式為[11-13]:

1.2.4 菌種的鑒定

1.2.4.1 菌種的形態(tài)特征觀察 將分離到的菌株于綠豆汁固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài),挑取單菌落涂片,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4.2 菌種的生理生化實(shí)驗(yàn) 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)該菌進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、碳源利用實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 16S rDNA的基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析 正向引物向引物P1(27F):5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′,反向引物P2(1492R):5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s,35次循環(huán),72 ℃ 7 min。PCR擴(kuò)增和測(cè)序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA基因序列作為參比對(duì)象,然后用CLUSTAL X軟件和MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建目標(biāo)菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹[14-16]。

1.2.5 菌體生長(zhǎng)條件的研究

1.2.5.1 碳源種類對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 分別選擇葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇作為綠豆汁培養(yǎng)基的碳源,添加量為1%,培養(yǎng)基初始pH6.8,115 ℃滅菌30 min,冷卻后加入菌種，10%接種量,30 ℃培養(yǎng)48 h,以菌體濃度即OD600值為指標(biāo),確定碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.5.2 碳源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 以葡萄糖作為綠豆汁培養(yǎng)基的碳源,添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,培養(yǎng)基初始pH6.8,115 ℃滅菌30 min,冷卻后加入菌種，10%接種量,30 ℃培養(yǎng)48 h。以菌體濃度即OD600值為指標(biāo),確定碳源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.5.3 氮源種類對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 分別以尿素、硫酸銨、氯化銨、酵母膏、牛肉膏作為綠豆汁培養(yǎng)基的氮源,添加量為1%,培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)為6.8,115 ℃滅菌30 min。冷卻后加入菌種，10%接種量,冷卻后加入菌種，30 ℃培養(yǎng)48 h。以菌體濃度即OD600值為指標(biāo),確定氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.5.4 氮源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的牛肉膏作為綠豆汁培養(yǎng)基的氮源,培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)為6.8,115 ℃滅菌30 min,冷卻后加入菌種，10%接種量,30 ℃培養(yǎng)48 h,以菌體濃度即OD600值為指標(biāo),確定氮源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.5.5 不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 在以1%葡萄糖作碳源,以2%牛肉膏作氮源的綠豆汁培養(yǎng)基中,分別用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0,115 ℃滅菌30 min,冷卻后加入菌種,10%的接種量,30 ℃下分別培養(yǎng)24、48、72 h,以菌體濃度即OD600值為指標(biāo),研究適宜的初始pH。

1.2.5.6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 在以1%葡萄糖作碳源、以2%牛肉膏作氮源、初始pH為5.0的綠豆汁培養(yǎng)基中,115 ℃滅菌30 min,冷卻后加入菌種，10%的接種量,分別在15、20、25、30、35、40、45 ℃下培養(yǎng)24、48、72 h,以菌體濃度即OD600值為指標(biāo),確定菌體最適生長(zhǎng)溫度。

1.2.5.7 菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 在上述單因素實(shí)驗(yàn)所得適宜培養(yǎng)條件下,按10%的接種量將種子培養(yǎng)液接種到綠豆汁培養(yǎng)基中。采用平板菌落計(jì)數(shù)法,每隔3 h測(cè)定一次培養(yǎng)液的活菌數(shù),然后以菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值作縱坐標(biāo),以培養(yǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)作出醋酸桿菌LLY11的生長(zhǎng)曲線[17]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0 進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及多重比較LSD(p<0.05),數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示[18-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

由表1可知,菌株LLY11 對(duì)淀粉的絮凝率最高,且傳代5次之后絮凝活性仍然較高,絮凝率無(wú)明顯的下降,因此,選用該菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

表1 由綠豆酸漿分離出的5株菌對(duì)淀粉的絮凝率Table 1 Isolated from five strains of mung bean sour liquid starch flocculating rate

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 菌株LLY11個(gè)體大小為(0.8～1.2 μm)×(1.5～2.5 μm),革蘭氏陰性菌,細(xì)胞呈橢圓或短桿狀,細(xì)胞分裂后呈鏈狀排布、無(wú)芽孢、不能運(yùn)動(dòng)。菌落大小為2～3 mm,菌落形態(tài)為菱形,顏色為乳黃色、不透明、表面光滑有光澤低凸且邊緣擴(kuò)展整齊。

2.2.2 生理生化特征 菌株LLY11生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步判斷菌株LLY11為醋酸桿菌屬。

表2 菌株LLY11生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain LLY11

2.2.3 16S rDNA序列分析結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 經(jīng)16S rDNA鑒定,菌株LLY11的16S rDNA序列全長(zhǎng)為1411 bp,經(jīng)Genbank比對(duì)與Acetobacterindonesiensis相似性達(dá)到99%。利用CLUSTAL X軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,菌株LLY11與Acetobacterindonesiensisstrain 7120034親緣關(guān)系最近,結(jié)果如圖1所示。

圖1 LLY11菌株基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed gene sequence diagram of LLY11

結(jié)合其菌體的群體形態(tài)特征、個(gè)體形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及菌株的16S rDNA序列比對(duì),確定菌株LLY11為醋酸桿菌,命名為AcetobacterindonesiensisLLY11,并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC No. 7480。

2.3 培養(yǎng)條件的研究

2.3.1 不同碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知,以葡萄糖作碳源的發(fā)酵液菌體OD600值最高,為0.785,所以選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源。

圖2 不同碳源對(duì)菌體濃度的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on cell concentration

2.3.2 碳源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 由圖3可知,葡萄糖添加1.0%時(shí),菌體OD600值最高為0.877,所以葡萄糖的添加量確定為1.0%。制作培養(yǎng)基時(shí),綠豆經(jīng)過(guò)20 min的煮沸后,綠豆本身含有的淀粉等糖類物質(zhì)會(huì)溶于培養(yǎng)基中,可以作為碳源被菌體所利用,因此使得在培養(yǎng)基中不需要添加較大量的葡萄糖作碳源,菌體也能夠達(dá)到最高生長(zhǎng)量。

圖3 碳源添加量對(duì)菌體濃度的影響Fig.3 Effect of carbon source addition on cell concentration

2.3.3 不同氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 由圖4可知,添加牛肉膏的菌體OD600值為0.902,最高,所以選擇牛肉膏作為綠豆汁培養(yǎng)基的氮源。與某些文獻(xiàn)中菌株所利用的氮源不相同,是由于菌株的種類不同能夠利用的氮源也不相同[21]。

圖4 不同氮源對(duì)菌體濃度的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on cell concentration

2.3.4 氮源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 由圖5可知,牛肉膏添加量為2.0%時(shí),菌體OD600值最高為0.956,所以牛肉膏的添加量確定為2.0%。與其它文獻(xiàn)中提到的菌種相比[21],最佳氮源的種類和添加量都不同,由于牛肉膏是從天然材料中提取出來(lái)的，與其他無(wú)機(jī)氮源相比，其中所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并非純化物，比例會(huì)有一定差別。

圖5 氮源添加量對(duì)菌體濃度的影響Fig.5 Effect of nitrogen source addition on cell concentration

2.3.5 不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 由圖6可知,培養(yǎng)時(shí)間為48 h、培養(yǎng)基的初始pH為5.0獲得的菌體OD600值最高，為0.684。與其他菌種的最佳初始pH相比[22],醋酸桿菌LLY11最佳初始pH偏低,可能是因?yàn)樵摼晔菑膒H較低的綠豆酸漿中分離出來(lái),對(duì)酸有一定的耐受力。

圖6 不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different initial pH values on cell growth

2.3.6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 由圖7可知,在30 ℃下，分別培養(yǎng)24、48、72 h,菌體OD600值最高,分別為0.385、0.507、0.529,說(shuō)明LLY11菌株最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。相較于其它細(xì)菌[23],LLY11菌株的最適培養(yǎng)溫度偏低,但是也屬于正常范圍內(nèi)。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of different culture temperature on cell growth

2.3.7 菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 由圖8可知,在接入綠豆汁培養(yǎng)基后,菌體生長(zhǎng)進(jìn)入延滯期。12～24 h菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體的活菌數(shù)大體上呈上升趨勢(shì)。24～39 h菌體的活菌數(shù)開始下降,可能是由于培養(yǎng)基中的某種營(yíng)養(yǎng)成分缺乏,但從39～42 h菌體的活菌數(shù)又明顯的上升,并達(dá)到最大值,為4.77×109。菌體的生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)雙峰,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因?yàn)榧?xì)胞在利用多種糖類組成的混合碳源時(shí)要按照一定的順序依次利用。大部分的細(xì)菌可以從不同碳源的混合物中選擇性消耗某些碳源并發(fā)生二次生長(zhǎng),這種現(xiàn)象被稱為分解代謝阻遏[24]。42 h后,由于菌體的大量繁殖,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗,有害代謝物不斷積累,菌體的活菌數(shù)急速的下降,進(jìn)入衰亡期。LLY11生長(zhǎng)曲線的穩(wěn)定期較短，可能是測(cè)定時(shí)間間隔較長(zhǎng)造成。

圖8 Acetobacter indonesiensis LLY11生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curve of the Acetobacter indonesiensis LLY11

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵的綠豆酸漿中篩選分離出5株對(duì)淀粉有絮凝活性的菌株,鑒定其中絮凝活性最高菌株LLY11為Acetobacterindonesiensis,命名為AcetobacterindonesiensisLLY11。采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)AcetobacterindonesiensisLLY11培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定菌體的適宜培養(yǎng)條件:分別以葡萄糖1%、牛肉膏2%作為綠豆汁培養(yǎng)基的碳源和氮源、培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)溫度30 ℃。在此條件下測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線,0～12 h,菌體處于延滯期;從12 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,活菌數(shù)量快速增長(zhǎng),分別在24 h和42 h菌體數(shù)量達(dá)到最高值。在30～40 h菌體的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,42 h后開始進(jìn)入衰亡期。

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