錢 波,廖 衫,劉斯悅,潘彩琳,何仲文,宋家樂,4,5,*

(1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院,廣西桂林 541100; 2.桂林醫(yī)學院預防醫(yī)學研究所,廣西桂林 541100; 3.廣西高校預防醫(yī)學重點實驗室,廣西桂林 541100; 4. CHA醫(yī)科大學食品生命工學系及生物技術(shù)研究所,韓國抱川 11160; 5.東南大學公共衛(wèi)生學院,江蘇南京 210009)

白茶是一種主要分布于我國福建、安徽和廣東等地的微發(fā)酵茶,屬六大傳統(tǒng)名茶之一。其中,以福建省福鼎地區(qū)所產(chǎn)之白茶質(zhì)量最為上乘[1]。近年來的研究表明,白茶具有較好的體外抗氧化[2]、肝損傷保護[3]、抗糖尿病[4-5]、抗癌和抗突變[6]、抑菌[7]及促進生殖健康[8-9]等多種生物學功效。

在正常的生命活動中,生物體會生成一些屬于生理代謝廢物的自由基。而這些自由基化學性質(zhì)活躍,在體內(nèi)的過多積累會造成生物有機大分子之間發(fā)生鏈式反應,引發(fā)細胞氧化損傷,最終導致癌癥、心血管疾病、免疫性疾病等多種退行性疾病的發(fā)生,減少氧化應激反應則是防治這些基本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[10]。研究提示,茶葉及其相關(guān)茶制品中所富含的茶多酚、黃酮、兒茶素等天然抗氧化物質(zhì)相對于人工合成的丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯二酚(TBHQ)具有較高的使用安全性[11],能有效清除自由基以減少氧化應激損傷對細胞造成的功能性損傷;參與調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化-抗氧化平衡,起到預防疾患發(fā)生的作用[12]。目前,白茶對氧化應激造成的細胞損傷的相關(guān)研究較少。因此,本研究就白茶乙醇提取物的抗氧化能力及對氧化受損細胞的保護效果進行初步研究,為其進一步用于保健食品的開發(fā)利用提供較為可靠的研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與儀器

福鼎白茶樣品 購于福建廣林福茶業(yè)有限責任公司(產(chǎn)地:福建省福鼎市,生產(chǎn)年份:2016年9月);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、沒食子酸(gallic acid,GAE)、蘆丁(rutin)、脫氧核糖、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、過氧化氫(H2O2)、抗壞血酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)和丁基羥基茴香醚(butylatedhydroxylanisole,BHA) 美國Sigma公司;DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 美國Thermo Scientific公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司;其他化學試劑 均為國產(chǎn)分析純;人結(jié)腸腺癌Caco-2細胞系 桂林醫(yī)學院生物技術(shù)學院鄒先瓊研究員饋贈,細胞源自中國科學院上海細胞資源中心。

EYELA N-1001S型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社;Biotek Elx808型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;756S型紫外可見光分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;Thermo 3110二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多公司上海有限公司;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白茶乙醇提取物的制備 參考魯?shù)劳鹊姆椒╗13],稱取10.00 g白茶樣品,用高速藥物粉碎機打磨成細粉,按液料比30∶1(v∶w)加入乙醇(300 mL),以100 r/min的速度使用電動搖床連續(xù)攪拌40 min。濾液經(jīng)布氏漏斗真空抽濾除雜。在70 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮濾液至干粉狀即得白茶乙醇提取物(得提取物3.98 g),置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 白茶乙醇提取物中總多酚、總黃酮含量測定 白茶乙醇提取物中總多酚含量按Folin-Ciocalteus法測定[14]。0.1 mL樣品中加入10%的碳酸鈉溶液(2 mL)反應5 min后,再加入福林酚試劑(0.1 mL)置避光處反應30 min。測定反應液在765 nm處的吸光度值?？偡雍恳訥AE為標準,通過標準曲線計算并以mg GAE/g為單位?？傸S酮含量測定采用三氯化鋁比色法。取0.5 mL樣品與2 mL蒸餾水混合,加入10%氯化鋁溶液(0.15 mL)后用分光光度計測定510 nm處吸光度值?？傸S酮含量以Rutin為標準計算并表示為mg Rutin/g。

1.2.3 白茶乙醇提取物的體外抗氧化能力測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 取100 μL不同濃度樣品液(50、100、250、500 μg/mL)、陽性對照品BHA(50 μg/mL)分別與DPPH標準液(152 μmol/L,100 μL)混勻,室溫下避光反應30 min后,以無水乙醇調(diào)零,用酶標儀在517 nm波長處測定吸光度[15]。清除率按照式(1)計算。

清除率(%)=[1-(OD樣品-OD樣品空白)/OD空白]×100

式(1)

式中:OD樣品為樣品液+DPPH試劑;OD樣品空白為樣品液+無水乙醇;OD空白為DPPH試劑+無水乙醇。

1.2.3.2 還原能力測定 在玻璃試管中加入0.5 mL不同濃度的樣品(50、100、250、500、1000 μg/mL)、2.5 mL PBS(0.2 mol/L,pH6.6)和1%鐵氰化鉀溶液(1 mL),充分混勻后置于50 ℃水浴鍋中充分反應20 min。反應液中加入10% TCA溶液(2.5 mL),搖勻,室溫靜置10 min。取2.5 mL反應液,加入蒸餾水2.5 mL和0.1%氯化鐵溶液(0.5 mL)并搖勻,反應10 min后用分光光度計在700 nm處讀取吸光度值。不同濃度的BHA(50、100、250、500、1000 μg/mL)用做陽性對照,還原力按照式(2)計算。

還原力=OD樣品-OD對照

式(2)

式中:OD樣品為樣品液+反應液;OD對照為反應液+乙醇溶液。

1.2.3.3 超氧陰離子的清除能力測定[16]加入不同濃度的樣品(50、100、250、500 μg/mL)和陽性對照品BHA(50μg/mL)各1 mL至玻璃試管中,3 mL磷酸鈉緩沖液(100 mmol/L,pH7.4),1 mL氯化硝基四氮唑藍(NBT,150 μmol/L)和1 mL的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH,468 μmol/L)試劑混勻,加入1 mL的在硫酸甲酯吩嗪(PMS,60 μmol/L)啟動反應?；旌戏磻镏糜?5 ℃水浴中進行5 min反應,用分光光度計測定反應液在550 nm處的吸光度。用1 mL的甲醇溶液替代樣品液用于空白對照[16]。清除率按照式(3)計算。

清除率(%)=(OD對照-OD樣品)/OD對照×100

式(3)

式中:OD樣品為樣品液+反應液;OD對照為反應液+甲醇溶液。

1.2.4 白茶乙醇提取物對細胞氧化損傷保護實驗

1.2.4.1 Caco-2細胞培養(yǎng)及分組 對數(shù)生長期Caco-2細胞,用DMEM細胞培養(yǎng)液制成密度1×105個/mL細胞懸液,在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)濕化培養(yǎng)。待細胞貼壁后,用含H2O2(150 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h制備氧化損傷模型細胞。氧化損傷模型細胞分別加入50、100、150 μg/mL的白茶乙醇提取物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 MTT法測定細胞存活率 細胞按照1.2.4.1中所述處理后,丟棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除上清液,加入二甲基亞砜100 μL/孔,避光振蕩30 min,測定490 nm處吸光度值。細胞存活率按式(4)計算。

細胞存活率(%)=(OD樣品/OD對照)×100

式(4)

式中:OD樣品為加藥細胞+反應液;OD對照為正常細胞+反應液。

1.2.4.3 細胞中MDA含量與抗氧化酶(SOD 和GSH-Px)活力的測定 依1.2.4.1處理細胞,丟棄培養(yǎng)液,加入適量PBS沖洗細胞,并置于冰上進行裂解。按照試劑盒操作要求進行SOD和MDA含量測定。Bio-RadQuick Start Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒測定細胞內(nèi)總蛋白。細胞內(nèi)SOD和GSH-Px酶活力和MDA含量均用細胞內(nèi)總蛋白量進行校正。SOD和GSH-Px以酶比活力單位(U/mg pro),MDA以ng/mg pro表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析,實驗結(jié)果均以均值(means)±標準偏差(SD)表示(所有實驗均重復3次),用單因素方差分析(ANOVA)進行多組之間均數(shù)的差異性檢驗,p<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶乙醇提取物中多酚、黃酮含量

白茶乙醇提取物中總多酚和總黃酮的含量如表1所示。其中,白茶乙醇提取物中總多酚含量為(343.00±27.90) mg GAE/g,這與段紅星和孫圍圍的研究[1]及黃赟的結(jié)果相似[18]。而提取物中總黃酮含量為(24.95±0.56) mg Rutin/g,高于黃赟的研究結(jié)果[18]。本次實驗白茶樣品為2016年產(chǎn)品,而黃赟所使用的白茶樣品為2011～2012年生產(chǎn),上述結(jié)果差異可能與樣品的制造年份差異有關(guān)。

表1 白茶乙醇提取物中總多酚和總黃酮含量Table 1 Contents of total polyphenols and flavonoids in white tea ethanol extracts

2.2 白茶乙醇提取物的體外抗氧化能力測定

2.2.1 白茶乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力 自由基是生命體進行有氧呼吸過程中所產(chǎn)生的一類生理性代謝副產(chǎn)物。過度蓄積的自由基可以導致細胞、組織以及特定的器官中發(fā)生氧化應激損傷,危及生物體健康。而通過適度的服用安全性較高的天然抗氧化劑來清除自由基,則有助抑制氧化應激對機體組織造成的損傷[9,11]。本次研究中,白茶乙醇提取物對DPPH自由基顯示出較強的清除能力(圖1)。其對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)為330.63 μg/mL,同時,白茶乙醇提取物對DPPH自由基清除能力隨著白茶提取物濃度的增加而升高,而這一結(jié)果與呂海鵬等結(jié)果相似[2]。

圖1 白茶乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of white tea ethanol extracts

2.2.2 白茶乙醇提取物的總還原力抗氧化劑 由于其自身具有多余電子,可以提供給自由基進行配對以降低自由基的活性。因此,物質(zhì)的還原力越強(即將亞鐵離子(Fe2+)還原成鐵離子(Fe3+)的供電子能力越大)則意味著其抗氧化性越強[15]。如圖2示,隨著白茶乙醇提取物濃度的增加,其總還原力也隨之增強,并呈現(xiàn)出劑量效應關(guān)系。在相同濃度作用下與人工合成抗氧化劑BHA相比發(fā)現(xiàn),白茶提取物自250 μg/mL開始其吸光度值開始高于相同濃度下BHA與反應試劑作用后的吸光度值。當處理濃度達到最高的1000 μg/mL時,白茶乙醇提取物的總還原力明顯強于BHA(p<0.05)。這一結(jié)果提示白茶乙醇提取物具有較強的還原能力。

圖2 白茶乙醇提取物的總還原能力Fig.2 Total reducing activity of white tea ethanol extracts注：*表示與同濃度BHA組具有顯著差異,p<0.05。

2.2.3 白茶乙醇提取物對超氧陰離子的清除能力 超氧陰離子是生物體內(nèi)一種較為穩(wěn)定的自由基,其過量存在時可與羥基結(jié)合導致細胞DNA損壞。同時,超氧陰離子還能誘發(fā)細胞的膜相系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應,造成細胞損傷[9]。如圖3示,隨著白茶乙醇提取物濃度的增加,其超氧陰離子清除能力也隨之增強。其對超氧陰離子的半數(shù)清除濃度(EC50)為342.90 μg/mL。而人工合成抗氧化劑BHA(50 μg/mL)的超氧陰離子清除率低于同等濃度下的白茶提取物。本研究結(jié)果與于淑池等報告相似[19]。

圖3 白茶乙醇提取物對超氧陰離子的清除能力Fig.3 Superoxide anion scavenging activity of white tea ethanol extracts

2.3 白茶乙醇提取物對H2O2所致氧化損傷的Caco-2細胞生存率的影響

作為經(jīng)典的氧化應激誘導劑H2O2會誘發(fā)細胞內(nèi)主要細胞器功能喪失,各種酶活性被抑制,導致細胞發(fā)生氧化損傷直至壞死[19]。如圖4所示,經(jīng)過4 h的H2O2(150 μmol/L)處理后Caco-2細胞存活率明顯較正常組細胞低(p<0.05)。而經(jīng)白茶乙醇提取物處理后的氧化損傷模型細胞存活率較未經(jīng)處理的氧化損傷模型組細胞存活率高,且細胞存活率隨著白茶提取物濃度的增高而升高,并呈現(xiàn)出一定的劑量效應關(guān)系(p<0.05)。白茶乙醇提取物可抑制H2O2對Caco-2細胞所造成氧化損傷并提高其生存率至85.6%。結(jié)果提示,白茶乙醇提取物具有一定的細胞保護功效,可通過提高細胞內(nèi)抗氧化酶活性改善氧化應激對腸道上皮細胞所造成應激損傷。而在Almajano等[21]的研究中也提示,較高濃度的白茶水提取物(100 μg/mL與200 μg/mL)能夠有效地防止H2O2(250 μmol/L)對STH紋狀體神經(jīng)前體細胞所造成的氧化應激損傷,并提高STH的細胞生存率。

圖4 白茶乙醇提取物對H2O2所致氧化損傷的Caco-2細胞生存率的影響Fig.4 Effect of white tea ethanol extractson cell viability in oxidative damaged Caco-2 cells exposed to H2O2注:*:與正常組比較p<0.05,#:與H2O2模型組比較p<0.05。

2.4 白茶乙醇提取物對H22所致氧化損傷的Caco-2細胞中MDA的影響

細胞發(fā)生氧化損傷時,富含不飽和脂肪酸的細胞磷脂膜在外源性氧化應激物質(zhì)的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應并生成具有一定細胞毒性的過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)[21]。由表2可知,H2O2的處理造成Caco-2細胞中MDA含量明顯較正常組細胞中的MDA含量增多(p<0.05)。當給予不同濃度的白茶乙醇提取物處理后,受損細胞內(nèi)Caco-2的MDA含量顯著下降。其中,白茶提取物高劑量組(150 μg/mL)處理的細胞中MDA的生成量最低。

2.5 白茶乙醇提取物對H2O2所致氧化損傷的Caco-2細胞中SOD和GSH-Px的影響

內(nèi)源性抗氧化酶SOD和GSH-Px可在正常生理狀態(tài)下,將超氧陰離子等自由基轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì),從而抑制氧化應激對機體所造成的損傷[22]。而過度的氧化應激壓力則會造成SOD和GSH-Px酶活性的降低[23]。H2O2處理顯著抑制了Caco-2細胞內(nèi)SOD和GSH-Px酶的活力(表2)。經(jīng)白茶提取物處理24 h后,50、100、150 μg/mL白茶處理組受損細胞SOD酶活力以及100和150 μg/mL白茶處理組細胞GSH-Px酶活力逐漸升高。與未經(jīng)過白茶提取物處理的模型組比較有顯著差異(p<0.05)。

表2 白茶乙醇提取物對H2O2所致氧化損傷的Caco-2細胞中MDA、SOD和GSH-Px的影響Table 2 Effect of white tea ethanol extractson levels of MDA,SOD and GSH-Px in oxidative damaged Caco-2 cells exposed to H2O2

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)白茶乙醇提取物具有良好的自由基與超氧陰離子清除能力和較強的總還原力。

白茶乙醇提取物可有效的抑制過氧化氫所造成的Caco-2腸上皮細胞死亡,提高了受損細胞的生存率。同時,白茶乙醇提取物還能提升細胞內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性,并能抑制受損細胞中氧化應激損傷標志物MDA的生成。而白茶乙醇提取物的體外抗氧化能力和對氧化受損細胞的保護作用可能源于其所含的多酚和黃酮類物質(zhì)[2]。此后,應就白茶乙醇提取物中的多酚和黃酮類物質(zhì)的組成與含量,及其在氧化損傷應激通路所處的分子調(diào)控作用進行研究。

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