曾廣富, 唐小海*, 黃源芳, 張雪梅

(1. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101; 2. 重慶萊美藥業(yè)股份有限公司, 重慶 401336)

熱療是通過吸熱材料吸收光能將其轉(zhuǎn)換成熱能,利用局部升溫殺死腫瘤達(dá)到治療惡性腫瘤的新型方法[1-2],是腫瘤治療中一種被廣泛研究的技術(shù)[3-5].該方法是針對(duì)腫瘤部位的治療,可以避免對(duì)其他組織造成損傷[6].

近紅外光(NIR)對(duì)生物組織無損害且具有一定的穿透力,可以作為熱療的重要光源[7],但是單純近紅外光的熱能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠達(dá)到治療腫瘤的效果.因此各種光能的轉(zhuǎn)換功能性材料應(yīng)運(yùn)而生,例如金納米顆粒[8-10]、納米碳管[11-12]和磁性納米粒子[13]等.這些新穎的納米材料因其獨(dú)特的近紅外光吸收性和光穩(wěn)定性,被迅速地開發(fā)和利用于熱療.納米碳作為熱療材料用于腫瘤治療得到較好的療效且無毒副作用[14].

光吸收納米材料卡納琳(CNSI)是以納米碳為原料制備的納米碳混懸注射液,顆粒直徑約為180 nm,具有高度的淋巴系統(tǒng)趨向性.CNSI作為中國(guó)唯一批準(zhǔn)上市的淋巴結(jié)示蹤劑,在腫瘤研究應(yīng)用以及臨床使用中[15-17],也有大量研究將其作為抗癌藥物載體[18-19].本文研究CNSI對(duì)肝癌模型作為吸熱材料的體外及體內(nèi)的熱療療效.

1 材料和方法

1.1藥品試劑、儀器與細(xì)胞株藥品試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素溶液、PBS緩沖液、新生小牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)、CNSI(重慶萊美藥業(yè)股份有限公司).

儀器:生物倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)、培養(yǎng)箱(SANYO)、離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)、水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、近紅外激光熱療儀.細(xì)胞株與動(dòng)物:HepG-2(四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))、KM小鼠(成都達(dá)碩生物科技有限公司).

1.2方法

1.2.1細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)CNSI體外熱療抗腫瘤活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2肝癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液.根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果調(diào)整細(xì)胞濃度,取24個(gè)玻璃培養(yǎng)皿,每瓶加入1 mL(約3×104個(gè)細(xì)胞)放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2孵箱.隔日加入用培養(yǎng)基稀釋的CNSI溶液(按培養(yǎng)基總體積將CNSI質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋至50 μg/mL).

將實(shí)驗(yàn)分為8組,分別為:對(duì)照組無處理,CNSI組加入50 μg/mL的CNSI,NIR組在1 W/cm2的NIR條件下連續(xù)照射3 d,每次3 min,實(shí)驗(yàn)組(CNSI+NIR 0.2 W/cm2、CNSI+NIR 0.4 W/cm2、CNSI+NIR 0.6 W/cm2、CNSI+NIR 0.8 W/cm2、CNSI+NIR 1 W/cm2)加入50 μg/mL的CNSI ,連續(xù)照射3 d,每次3 min.NIR照射前加入CNSI溶液,實(shí)驗(yàn)完成后用紅外熱像儀測(cè)量溫度.每次照射完成后更換培養(yǎng)基,最后一次照射后繼續(xù)培養(yǎng)2 d,用胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù),并計(jì)算

1.2.2CNSI體內(nèi)熱療抗腫瘤活性 將KM小鼠32只隨機(jī)分為4組,小鼠右前腿部接種HepG-2肝癌細(xì)胞(2×106個(gè)/只),待腫瘤體積約100 mm3時(shí)進(jìn)行治療.對(duì)照組無處理,CNSI組在腫瘤部位注射50 μL CNSI,NIR組在0.8 W/cm2的NIR條件下連續(xù)照射3 d,每次3 min,CNSI+NIR組在腫瘤部位注射50 μL CNSI,NIR為0.8 W/cm2的條件下連續(xù)照射3 d,每次3 min.

第一次治療完成24 h后,每組取一只小鼠,將腫瘤部位取出做病理切片.觀察、記錄小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況,每2～3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤體積.測(cè)量方式為按直角測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)軸a和短軸b,計(jì)算腫瘤體積為

V=ab2/2.

小鼠飼養(yǎng)條件均為溫度25 ℃、濕度60%、SPF級(jí)(無特定病原體),實(shí)驗(yàn)過程均遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例及使用指南.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示.

2 結(jié)果與討論

2.1細(xì)胞層面的抑制作用NIR照射時(shí)細(xì)胞溫度上升不明顯,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎無影響.CNSI組也對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無影響.實(shí)驗(yàn)組抑制率是隨著功率的升高而升高,CNSI+NIR 0.2 W/cm2抑制率為25.45%,CNSI+NIR 0.4 W/cm2抑制率為46.72%,CNSI+NIR 0.6 W/cm2抑制率為76.43%,CNSI+NIR 0.8 W/cm2抑制率為99.02%,CNSI+NIR 1 W/cm2抑制率為99.75%(如圖1).由此可以看出實(shí)驗(yàn)組NIR條件為0.8 W/cm2時(shí)達(dá)到較為理想的治療效果.

圖 1 不同NIR功率細(xì)胞熱療結(jié)果

2.2體內(nèi)抑制作用從病例圖片看出CNSI+NIR組腫瘤細(xì)胞大面積死亡達(dá)到預(yù)期治療效果(圖2(a)),NIR組對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用(圖2(b)),空白組與CNSI組腫瘤生長(zhǎng)較好(圖2(c)和(d)).

CNSI對(duì)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)無影響,NIR組對(duì)腫瘤的抑制作用不明顯,而CNSI+NIR組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有顯著抑制效果.

3次治療完成后,從腫瘤生長(zhǎng)體積曲線(圖3(a))可以看出空白對(duì)照與CNSI組腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致,CNSI對(duì)腫瘤的整個(gè)治療過程均無影響;單NIR組前期有較小的抑制作用,但最后腫瘤仍然繼續(xù)生長(zhǎng)且與空白組幾乎一致;CNSI+NIR組照射后腫瘤停止生長(zhǎng)且30 d后仍未復(fù)發(fā).空白組、CNSI組和NIR組小鼠腫瘤均無結(jié)痂, CNSI+NIR組小鼠治療10 d后腫瘤開始結(jié)痂,20 d后結(jié)痂脫落(圖

(a)近紅外+卡納琳

(b)近紅外

(c)對(duì)照

(d)卡納琳

圖2腫瘤組織病例切片圖

Fig.2Tumortissuecaseslice

3(b)).結(jié)痂證明了CNSI能夠吸收光能并將其迅速轉(zhuǎn)換為熱能,達(dá)到局部升溫的作用,從而殺死腫瘤細(xì)胞,而CNSI的示蹤性將其分散于整個(gè)腫瘤,使得腫瘤被全方位治療,腫瘤細(xì)胞死亡后形成結(jié)痂,然后逐漸脫落達(dá)到治療的作用.

3 結(jié)論

研究表明惡性腫瘤比正常細(xì)胞更易受熱刺激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡[20].功能性納米材料作為熱療的熱能轉(zhuǎn)換器備受廣大研究者的關(guān)注[14].

本研究選擇的CNSI具有光穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)均一以及良好的淋巴結(jié)示蹤性,注射到組織內(nèi)的CNSI不進(jìn)入血管,可迅速進(jìn)入淋巴管或被巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入毛細(xì)淋巴管,滯留、聚集在淋巴結(jié),使淋巴結(jié)黑染,因此CNSI能夠有效聚集在腫瘤部位,其主要成分納米炭是良好的吸熱材料.

腫瘤部位注射CNSI后,在NIR為0.8 W/cm2的條件下治療小鼠肝癌模型,對(duì)各組的治療效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示:CNSI+NIR(0.8 W/cm2)組具有顯著的抗腫瘤效果,可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng).CNSI作為光吸收納米材料,具有光穩(wěn)定性強(qiáng)、近紅外特征吸收等顯著優(yōu)點(diǎn),可以有效地應(yīng)用于腫瘤光熱治療方面.

圖 3 CNSI體內(nèi)熱療示意圖

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