王媛媛 張雪芹 袁菲菲 余培凡 吳飄揚(yáng) 田 宇

(蚌埠醫(yī)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)院，蚌埠 233030)

川牛膝為莧科植物川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)的干燥根，氣微、味甜，功能為逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋。懷牛膝為莧科植物牛膝(AchyranthesbidentataB1.)的干燥根，氣微、味微甜而稍苦澀，功能為逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，利尿通淋，引血下行[1]。川牛膝和懷牛膝多糖由兩種植物通過提取分離獲得，具備較高的生物活性，如抗炎、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等，臨床上被用于免疫調(diào)節(jié)及腫瘤治療[2-6]。目前，國內(nèi)外研究關(guān)于川牛膝和懷牛膝多糖的藥理活性區(qū)別報道較少，本文采用ELISA技術(shù)[7-9]，通過檢測兩種多糖對小鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞中PGE2、TNF-α、IL-12因子分泌的影響，探究兩種多糖的抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性，為后期兩種多糖的臨床選用研究提供支持。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱(HF151型，力康生物醫(yī)療有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan FC型，美國Thermo Fisher公司)；流式細(xì)胞儀(FACSCanto II型，美國BD公司)；超凈工作臺(RL119952型，上海榮豐儀器公司)；低溫高速離心機(jī)(TGL-16k型，常州國華科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清(批號：10099-141，Gibco公司)；1640培養(yǎng)基干粉(批號：31800022，Gibco公司)；胰酶干粉(批號：25200056，Gibco公司)；PBS緩沖液(批號：SH30256.01B，HyClone公司)。

兩種多糖由實(shí)驗(yàn)室通過水提醇沉法[10]制備。

2 方法

2.1 Ana-1細(xì)胞的培養(yǎng)

取Ana-1細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2條件下，用含10%的小牛血清、青霉素(1 ×105U/L)及鏈霉素(100mg/L)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞基本長滿后，用胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)器或細(xì)胞板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104/ml。接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種200μl細(xì)胞懸液。接種24h后把培養(yǎng)孔分為空白對照組、各濃度的兩種牛膝多糖溶液受試組，每個樣品設(shè)3復(fù)孔，用培養(yǎng)液洗滌3次，然后空白對照組更換含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，受試組更換含10%小牛血清及各濃度多糖樣品的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

2.2 ELISA法檢測兩種多糖的抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性

取細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒方法測定空白對照組和受試組各樣品細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2、TNF-α、IL-12的水平，于450nm波長處測定OD值。計算兩種多糖樣品各濃度溶液抑制Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的抑制率及促進(jìn)Ana-1細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12的增值率，做出抑制率及增值率/%-濃度/μg·ml-1曲線。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 兩種多糖對Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響

圖1 兩種多糖抑制Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的抑制率-濃度曲線

由抑制率-濃度曲線可以看出，兩種多糖對Ana-1產(chǎn)生PGE2具有不同程度的影響，且懷牛膝多糖在一定濃度范圍內(nèi)對Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的抑制率與其濃度呈正相關(guān)；對抑制率-濃度曲線進(jìn)行擬合并計算結(jié)果表明，懷牛膝多糖抑制Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的IC50值為(46.151±1.408)μg/ml；川牛膝多糖抑制Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的能力較弱，并未計算出IC50值，在此模型下，懷牛膝多糖顯示出一定的抗炎活性優(yōu)勢。

3.2 兩種多糖對Ana-1細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12的影響

圖2 兩種多糖促進(jìn)Ana-1細(xì)胞分泌TNF-α的增值率-濃度曲線

圖3 兩種多糖促進(jìn)Ana-1細(xì)胞分泌TNF-α的EC50值

圖4 兩種多糖促進(jìn)Ana-1細(xì)胞分泌IL-12的增值率-濃度曲線

由增值率-濃度曲線可以看出，兩種多糖對Ana-1細(xì)胞分泌TNF-α具有一定的促進(jìn)作用，對曲線進(jìn)行擬合并計算結(jié)果表明，川牛膝多糖、懷牛膝多糖促進(jìn)Ana-1細(xì)胞中TNF-α因子分泌的EC50值分別為(21.247±3.521)μg/ml、(23.532±1.160)μg/ml，經(jīng)t檢驗(yàn)兩者無顯著性差異(P>0.05)；川牛膝和懷牛膝多糖促進(jìn)Ana-1細(xì)胞分泌IL-12因子的能力不明顯，均未算出EC50值。

4 討論

本文通過ELISA技術(shù)檢測川牛膝和懷牛膝多糖對Ana-1細(xì)胞分泌PGE2、TNF-α、IL-12因子的作用，評價兩種多糖的抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性。研究結(jié)果顯示，兩種多糖對Ana-1細(xì)胞分泌PGE2、TNF-α、IL-12因子具有不同程度的影響，在抑制Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的測試模型中，懷牛膝多糖顯示出一定的抗炎活性優(yōu)勢；在促進(jìn)Ana-1細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12的測試模型中，兩種多糖主要通過促進(jìn)Ana-1細(xì)胞中TNF-α因子分泌的途徑產(chǎn)生免疫活性，且在此模型下川牛膝多糖和懷牛膝多糖無顯著性差異，揭示兩者的免疫調(diào)節(jié)活性無統(tǒng)計學(xué)差異。

炎癥和免疫作為機(jī)體對外來入侵物質(zhì)的兩種不同反應(yīng)，它們的作用機(jī)制涉及很多共同的細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)，所以在疾病發(fā)生的過程中相互聯(lián)系，如免疫可以增強(qiáng)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥過程。相對于川牛膝多糖而言，懷牛膝多糖不僅表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性，還表現(xiàn)出較好的抗炎活性，它可以通過多途徑多通路發(fā)揮藥理活性，并有可能通過免疫調(diào)節(jié)功能強(qiáng)化抗炎作用，發(fā)揮抗炎、免疫協(xié)同作用。因此，其在抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性方面呈現(xiàn)出更強(qiáng)的優(yōu)勢。本文結(jié)果為牛膝多糖工業(yè)生產(chǎn)中的原料選擇及兩種多糖的臨床選用提供了參考依據(jù)。

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