周愛萍，張敏，李文俠，張增賢，沙莎，董鴻智，胡群英

（1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究高校重點實驗室，陜西 咸陽712082；2.陜西省咸陽市肺科醫(yī)院 檢驗科，陜西 咸陽 712046；3.陜西省西安市胸科醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安 710061）

結(jié)核病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)一直居高不下，我國是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一，發(fā)病率居世界第2位。異煙肼作為消滅結(jié)核分枝桿菌作用最強的全殺菌藥物，自1952年首次用于結(jié)核病的臨床治療以來一直是抗結(jié)核治療的首選藥物。近年來，結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥情況日益嚴重，給結(jié)核病的防治工作帶來巨大挑戰(zhàn)。2012年一項研究中，中國結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥率為20.9%[1]，高于全球水平11.5%。異煙肼耐藥是結(jié)核菌多重耐藥的基礎(chǔ)，對異煙肼耐藥菌株的分子特征與其傳播之間的關(guān)系研究非常有意義。結(jié)核菌耐藥性的產(chǎn)生主要是由染色體DNA發(fā)生突變引起。目前已發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼的相關(guān)基因有katG、inhA、aphC、oxyR、mabA、kasA等基因，其中以katG和inhA基因的突變關(guān)系最為密切[2-3]。95%的異煙肼耐藥與katG基因突變有關(guān)[4]，其中最常見是KatG S315T突變，不同地區(qū)的異煙肼耐藥臨床菌株發(fā)生突變的相關(guān)基因及突變頻率有差異[5]。

本研究擬對臨床分離結(jié)核分枝桿菌進行藥敏試驗并采用定向缺失多重PCR(deletion-targeted multiplex PCR，DTM-PCR)方法對異煙肼耐藥菌株進行的基因分型研究，分別利用多重等位基因特異PCR（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）和PCR-DNA測序方法對其katG315和inhA-15突變熱點進行檢測。了解西安市異煙肼耐藥臨床分離菌株的分子特征。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2011年1月-2011年12月西安結(jié)核病院住院患者的痰液標本117株，且確診為結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥臨床菌株。經(jīng)BACTAC MGIT960分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)并經(jīng)過菌種鑒定。標準菌株H37Rv由國家參比實驗室提供作為對照株。2×Taq PCR Master Mix、Taq酶（購自北京天根生化科技有限公司），三磷酸脫氧核苷（購自美國Sigma公司），DNA ladder（購自加拿大MBI Fermentas公司），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗按照全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)說明書進行操作，分別在MGIT960培養(yǎng)管中加入鏈霉素、異煙肼、利福平和乙胺丁醇，使其終濃度分別為1.0、0.1、1.0 及 5.0 μg/ml。

1.2.2 分枝桿菌基因組DNA提取收集經(jīng)BACTAC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)及鑒定的異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床菌株，首先對培養(yǎng)管80℃水浴3 h滅活以消除管中結(jié)核分枝桿菌的傳染性。收集的菌體用水煮法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA，具體步驟如下：200 μl TE緩沖液重懸菌體，100℃煮沸10 min，立即置于冰上5 min，12 000 r/min離心10 min，上清可直接用于PCR擴增。

1.2.3 MAS-PCR及PCR-DNA測序根據(jù)文獻[6-7]針對katG315和inhA-15合成MAS-PCR引物（katG-F/katG315-R、inhA-15-F/inhA-15-R）及PCR-DNA測序引物（katG-F/katG-R、inhA-F/inhA-R）（見表1）。為確保MAS-PCR結(jié)果的準確性，各隨機選擇10株MAS-PCR結(jié)果不同的菌株擴增目的片段并進行測序。katG315位點MAS-PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)目的片段的有無，判斷檢測是否存在突變。PCR-DNA測序反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。目的片段PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送上海美吉生物技術(shù)有限公司進行序列測定，并將測序結(jié)果與GeneBank進行比對。

1.2.4 DTM-PCR基因分型根據(jù)文獻[6]合成3條用于DTM-PCR基因分型的引物（Beijng-P1，Beijing-P2，Beijing-P3）。H37Rv基因組DNA作為非北京型對照，PCR反應(yīng)體系及條件參考文獻[7]進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)產(chǎn)物片段大小判斷其是否為北京型菌株。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 藥敏實驗結(jié)果

117株異煙肼耐藥菌株中，有73株為多重耐藥（62.39%），其中對4種一線抗結(jié)核藥物全部耐受有35株（29.91%），耐藥結(jié)果（見表2）。MDR-TB（多耐藥結(jié)核菌）同時耐受異煙肼和利福平的結(jié)核菌；PDRTB（多重耐藥結(jié)核菌），MDR-TB以外至少耐受2種抗結(jié)核藥物的結(jié)核菌（R：利福平；H：異煙肼；E：乙胺丁醇；S：鏈霉素）。

2.2 katG315和inhA-15位點突變

部分菌株MAS-PCR結(jié)果（見圖1）。117株異煙肼耐藥菌株中，81株（69.23%）存在katG315位點突變，10株（8.55%）存在inhA-15位點突變（其中3株檢測到雙位點突變）。在73株MDR-MTB菌株中，有49株存在katG315突變，5株存在inhA-15突變。MDR菌株中katG315突變菌株所占比例高于野生型菌株（67.12% vs 32.88%）。inhA-15突變菌株在MDR-MTB中的比例也高于其他耐藥菌株（6.85% vs 4.54%）。

2.3 DTM-PCR基因分型結(jié)果

表2 異煙肼耐藥菌株的藥敏結(jié)果 （n =117）

圖1 部分結(jié)核分枝桿菌katG315位點及inhA-15位點MAS-PCR結(jié)果

圖2 部分結(jié)核分枝桿菌DTM-PCR結(jié)果

部分菌株DTM-PCR結(jié)果（見圖2）。如其電泳條帶為1 500 bp判斷為非北京基因型菌株，電泳條帶為786 bp判斷為北京基因型菌株。117株異煙肼耐藥菌株有104株為北京型（88.89%），13株為非北京型菌株。

3 討論

作為一個全球公共衛(wèi)生問題，結(jié)核病目前嚴重威脅著人類的健康。目前抗結(jié)核病一線藥物有4種（異煙肼、利福平、鏈霉素及乙胺丁醇）。當前，全球結(jié)核病耐藥形勢異常嚴峻，多重耐藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-MTB，至少同時耐受異煙肼和利福平的結(jié)核桿菌）比例居高不下，結(jié)核菌耐藥菌株的產(chǎn)生和播散使結(jié)核病的防治困難重重。本研究通過對來自西安市結(jié)核病院的117株異煙肼耐藥臨床菌株耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)目前西安市結(jié)核桿菌耐藥形勢的嚴峻性，應(yīng)引起有關(guān)部門重視。

異煙肼是1912年首次合成的1種酰肼類化學(xué)藥物，其抗菌作用非常強。但近年來結(jié)核分枝桿菌INH耐藥性及耐多藥性呈上升趨勢。2014年世界衛(wèi)生組織報告INH耐藥情況在新發(fā)病例中占8.1%，在經(jīng)治病例中占14.0%。我國INH耐藥情況更是嚴重，根據(jù)2010年我國進行第5次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，INH初始耐藥率為28.2%，獲得性耐藥率為30.8%[7]。

結(jié)核菌耐藥性產(chǎn)生主要是由染色體DNA發(fā)生突變引起。與異煙肼耐藥關(guān)系最為密切基因突變位點為katG315位點。katG基因是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因，315位點是katG與活性密切相關(guān)的位點，該位置發(fā)生突變可阻礙katG活性位點的甲基化，從而影響INH與katG結(jié)合，導(dǎo)致INH不能被活化，失去對結(jié)核桿菌的殺傷作用。該類型突變在耐受異煙肼結(jié)核桿菌中占50%～90%，并且與高濃度異煙肼耐受相關(guān)[8]。

研究表明，世界各地結(jié)核分枝桿菌katG315位點突變菌株流行與結(jié)核病流行相一致。與結(jié)核病低負擔地區(qū)相比，結(jié)核病高負擔地區(qū)katG315位點突變菌株更為流行。在我國不同地區(qū)間，該位點突變在異煙肼耐藥菌株中所占比例差別較大。2013年研究發(fā)現(xiàn)，合肥地區(qū)其比例為42.6%[9]，2010年中國東部農(nóng)村一項研究中，異煙肼耐藥菌株中，存在該位點突變的菌株為61.8%[10]。本研究117株異煙肼耐藥菌株中，有81株（69.23%）存在katG315位點突變，與南非報道水平相當（64%），高于巴塞羅納（55%）、新加坡（26%）及芬蘭（7%）等地區(qū)，而低于俄羅斯西北部地區(qū)（93%）。西安地區(qū)異煙肼耐藥臨床菌株以katG315突變?yōu)橹?，提示該地區(qū)結(jié)核病疫情嚴重。

活化INH作用于細菌胞壁脂肪酸合成的靶位有多個，inhA蛋白是公認的原始靶位。有文獻報道該基因及其啟動子區(qū)域突變在異煙肼耐受的結(jié)核菌株中占21%～24%，并且inhA-15位置突變比inhA編碼基因突變更為常見[11]。當inhA-15位點發(fā)生單個堿基置換后，其啟動子活性增強，使inhA基因過度表達，從而削弱INH殺菌效能。該位點發(fā)生突變的菌株通常與低濃度耐藥相關(guān)。本研究中117株異煙肼耐藥菌株中，有10株存在inhA-15位點突變，低于有關(guān)文獻報道的比例。

流行病學(xué)的研究方法能預(yù)測疾病暴發(fā)流行及其傳播模式。以結(jié)核分枝桿菌基因型分型技術(shù)為基礎(chǔ)的分子流行病學(xué)可研究結(jié)核菌株之間的遺傳學(xué)關(guān)系，有助于探討多種重要的流行病學(xué)問題。北京基因型菌株是結(jié)核分枝桿菌地域分布最為廣泛的菌株，大約占世界各地菌株13%，東亞50%。也是中國臨床MTB的優(yōu)勢菌株。有研究表明，北京型菌株與耐藥性有一定相關(guān)性[12]，并具有更強的毒力和傳播性[13]。間隔區(qū)寡核苷酸分型法是鑒定北京基因型菌株的金標準，但該方法操作復(fù)雜、成本較高。本研究采用DTM-PCR法是高謙等人根據(jù)北京基因型菌株的特異分子標志RD105缺失區(qū)建立起來一種多重PCR反應(yīng)，利用3條引物通過對RD105區(qū)檢測，簡單快速地鑒定北京型菌株[6]。本研究對117株異煙肼耐藥臨床菌株進行DTM-PCR分型，發(fā)現(xiàn)104株為北京型菌株。與中國其他地區(qū)一樣，北京型菌株是目前西安市流行的優(yōu)勢菌株。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)北京型菌株是西安市異煙肼耐藥臨床菌株的主要基因型，其藥敏特性以MDR為主，引起耐藥的主要突變?yōu)閗atG315位點突變。鑒于目前西安市結(jié)核桿菌耐藥形勢的嚴峻性，強烈建議充分調(diào)動各方面力量，加大結(jié)核病防治工作力度，重視耐藥菌株監(jiān)測，加強用藥合理性和全程性，及時遏制耐藥菌株的流行和傳播。

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