劉勁，李薇，段華新，羅科玲，周煦

（湖南省人民醫(yī)院 1.腫瘤科，2.血液科，3.重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是血液系統(tǒng) 造血干細(xì)胞的一種惡性克隆增殖性疾病，其起病急，惡性程度高，嚴(yán)重威脅人類生命健康。異常造血細(xì)胞的增殖分化異常導(dǎo)致正常血細(xì)胞減少，臨床主要表現(xiàn)為貧血、出血和感染等征象[1]。急性白血病的發(fā)生受多基因異常調(diào)控的疾病，許多基因包括KIT、FLT3、NPM1和CEBPA均在急性白血病中表達(dá)失調(diào)，且與疾病的療效及預(yù)后判斷中具有一定的價(jià)值[2]。急性白血病的化療耐藥是治療過(guò)程中遇到的一大難題，乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）基因編碼重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在白血病多藥耐藥方面發(fā)揮重要的作用[3-4]，影響患者的療效和預(yù)后。目前尚無(wú)骨髓BCRP基因表達(dá)與急性白血病患者預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)初發(fā)急性白血病患者骨髓BCRP基因表達(dá)，隨訪患者預(yù)后，分析骨髓BCRP基因表達(dá)與急性白血病預(yù)后的關(guān)聯(lián)，為治療方案的制定和優(yōu)化提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月-2014年12月入住我院血液內(nèi)科的急性白血病患者67例。其中，男性36例，女性31例；年齡19～68歲，平均39.0歲，中位年齡40歲。入選患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)制定的初發(fā)急性白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色及免疫學(xué)分型，其中AML 42例，ALL 25例。同時(shí)還選擇50例健康志愿者作為對(duì)照組。男性30例，女性20例；年齡20～65歲，平均36.2歲。白血病患者與健康志愿者在性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 標(biāo)本收集及骨BCRP基因表達(dá)檢測(cè)

取EDTA抗凝骨髓標(biāo)本1ml，用生理鹽水稀釋2倍，緩慢加于2ml淋巴細(xì)胞分離液上，3000r/min離心20min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，并用生理鹽水洗滌3次后通過(guò)Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA，具體按Trizol說(shuō)明書操作。將RNA濃度調(diào)整至1μg/μl，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）合成cDNA后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）（TaKaRa公司）檢測(cè)骨髓BCRP基因表達(dá)。所用引物序列如下：BCRP正向5'-GTTCTC AGCAGCTCTTCGGC-3'，反向5'-TCCTCCAGACACAC CACGGA-3'；β-actin正 向 5'-CCATTGGCAATGAG CGGTTC-3'， 反 向 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10μl，PCR正向引物（10μmol/L）0.2 μl，PCR反向引物（10 μmol/L）0.2 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，cDNA 1 μl，H2O 8.2 μl。qRT-PCR 在 ABI 7500儀進(jìn)行，反應(yīng)條件如下，95℃ 40 s，（95℃ 5 s、60℃ 35 s）×40個(gè)循環(huán)，記錄熔解曲線和解鏈溫度，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，并計(jì)算平均值。將健康志愿者的BCRP平均表達(dá)水平定義為1，通過(guò)白血病患者的2-ΔΔCt法計(jì)算得出患者骨髓BCRP基因表達(dá)[6]。

1.3 預(yù)后隨訪

從初次確診后開始隨訪，隨訪時(shí)間截止2016年9月，隨訪時(shí)間為1～35個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為27個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，利用t檢驗(yàn)比較組間差異；計(jì)數(shù)資料以百分比或率的形式表示，利用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；骨髓BCRP基因表達(dá)與患者生存期分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組BCRP基因表達(dá)比較

對(duì)67例白血病患者和50例健康志愿者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。白血病患者BCRP基因表達(dá)為（3.0±1.2），較健康志愿者（1.2±0.6）升高（P＜0.01），見表1。

表1 急性白血病患者和健康志愿者情況比較

2.2 不同BCRP基因表達(dá)的AL患者情況比較

依照白血病患者BCRP基因表達(dá)均值（3.0），將其分為BCRP高表達(dá)組（4.1±0.7）和BCRP低表達(dá)組（2.1±0.5），兩組間白血病患者年齡、性別和分型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BCRP高表達(dá)組白血病患者初始WBC計(jì)數(shù)較BCRP低表達(dá)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

2.3 不同BCRP基因表達(dá)的AL患者生存分析

AL患者的生存時(shí)間為25個(gè)月，其中BCRP高表達(dá)組急性白血病患者的中位生存時(shí)間為15個(gè)月，BCRP低表達(dá)組急性白血病患者的中位生存時(shí)間為31個(gè)月，兩組生存分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Logrank=21.78，P＜0.05），見附圖。

表2 不同BCRP基因表達(dá)AL患者情況比較

附圖 AL患者BCRP基因高低表達(dá)組間的生存曲線

3 討論

隨著社會(huì)生活方式的改變及環(huán)境污染問(wèn)題的日漸嚴(yán)重，AL的發(fā)生率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。而患者的療效和預(yù)后各異，這與疾病的年齡、分型或基因異常等因素相關(guān)，目前對(duì)于臨床AL預(yù)后判斷尚缺乏特異性的指標(biāo)[7]。而對(duì)于化療的耐藥是影響白血病療效和預(yù)后的一個(gè)重要因素[8]，化療耐藥主要是受到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的調(diào)控[9]，BCRP作為其中的一種日益受到研究者的關(guān)注。

本研究中，筆者首先檢測(cè)AL組和健康志愿者骨髓BCRP基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AL患者骨髓BCRP基因表達(dá)高于健康人（P＜0.01）。按照BCRP基因表達(dá)的均數(shù)值將白血病患者分為BCRP高表達(dá)組和BCRP低表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)BCRP高表達(dá)組患者初始白細(xì)胞計(jì)數(shù)更高（P＜0.001），同時(shí)中位生存時(shí)間更短，生存分析比較有差異，提示骨髓BCRP基因表達(dá)水平可能作為一個(gè)AL患者預(yù)后判斷的的生物學(xué)標(biāo)志物。

BCRP基因定位于染色體4q22.1，其編碼蛋白定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞核，膜表面的BCRP能將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，從而細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，影響化療療效[10]。能夠影響氨甲喋呤和阿霉素等常用化療藥物，引起多藥耐藥的發(fā)生[11]。以往的研究也證實(shí)，急性白血病時(shí)BCRP基因表達(dá)升高[12]，與本研究中的結(jié)論一致，且不同的骨髓BCRP基因表達(dá)組之間患者初始白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及生存率也有差異，表明骨髓BCRP基因表達(dá)對(duì)于AL預(yù)后預(yù)測(cè)有一定的價(jià)值。同時(shí)，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)水平，結(jié)果快速且準(zhǔn)確，且易于臨床檢驗(yàn)的開展[13]。

綜上所述，AL患者骨髓BCRP基因表達(dá)高于健康志愿者，且BCRP高表達(dá)患者的預(yù)后更差。骨髓BCRP基因表達(dá)對(duì)于AL的預(yù)后有著重要的意義，能為AL患者治療方案的制定和優(yōu)化提供依據(jù)，并輔助判斷其預(yù)后，同時(shí)尚需更大樣本量的研究以明確骨髓BCRP基因表達(dá)與AL預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步提高其臨床指導(dǎo)應(yīng)用價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)：

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