趙麗輝，易冰，孟鳳嬌

（廣東省中山市人民醫(yī)院 1.分子診斷中心，2.病理科，廣東 中山 528403）

乳腺癌是當今威脅女性健康的第一大惡性腫瘤，其發(fā)病率正以每年5%的速度呈增長狀態(tài)，且年輕、低齡化的趨勢越來越明顯[1-3]，目前乳腺癌的治療除手術(shù)外，還包括激素治療、化療和靶向治療，而在化療方案中蒽環(huán)類藥物具有重要作用，但有效率僅為25%～30%[4-5]，拓撲異構(gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TOP2A）是蒽環(huán)類抗生素的靶酶，有推斷稱使用TOP2A基因狀態(tài)來預(yù)測患者對含蒽環(huán)類藥物療效的治療方案更為準確[6]，TOP2A的擴增或缺失與蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性之間相關(guān)性已經(jīng)闡明[7-8]，研究發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類藥物作用于TOP2A蛋白，產(chǎn)生細胞毒作用，誘導(dǎo)細胞凋亡，但蒽環(huán)類藥物具有嚴重的毒副作用，因此需要綜合評估其臨床獲益后使用。浸潤性導(dǎo)管癌是浸潤性乳腺癌中最常見的病理類型，TOP2A基因參與乳腺癌細胞的復(fù)制，人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）、雌激素受體（estrogen receptor,ER）、孕激素受體（porgesterone receptor，PR）、Ki67蛋白是乳腺癌預(yù)后的重要生物學因子，是TOP2A基因相關(guān)蛋白。本文通過FISH檢測方法對371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者進行TOP2A基因檢測，分析其基因狀態(tài)與ER、PR、Ki67、HER2蛋白表達情況及臨床病理特征之間的相關(guān)性，以期對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌在蒽環(huán)類藥物的使用上提供更為準確的預(yù)后和預(yù)測信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月-2017年5月中山市人民醫(yī)院就診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者371例。男性3例，女性368例；年齡25～86歲，≥50歲191例，＜50歲180例；手術(shù)切除116例，穿刺活檢255例；左乳190例，右乳181例。所有患者術(shù)前均未行放、化療或分子靶向治療，標本均按常規(guī)行10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，由病理科醫(yī)師閱片確診為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑FISH檢測GLP TOP2A/GSP 17探針試劑盒（購自廣州安必平生物技術(shù)有限公司），IHC檢測（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），標記均設(shè)陽性對照組。

1.2.2 儀器Thermo Brite S500-24熒光原位雜交儀，Olympus BX51熒光顯微鏡，JENOPTIK攝像頭及FISH分析軟件。IHC檢測使用VENTANA公司全自動免疫組織化學儀。

1.3 方法

1.3.1 FISH檢測TOP2A基因狀態(tài)連續(xù)切厚3～4 μm石蠟切片2張（1張備片），65℃恒溫箱烤片過夜；二甲苯脫蠟15 min×2；無水乙醇10 min；梯度酒精（100%、95%、80%、70%）至去離子水；100℃煮片25 min；晾干后37℃恒溫臺上胃蛋白酶消化3～10 min；2×SSC緩沖液洗片5 min×2；梯度酒精（70%、80%、95%及100%）脫水，自然晾干；滴加TOP2A雜交液，封片，在雜交儀上變性雜交10～18 h，2×SSC緩沖液洗片10 min與0.1%NP～40緩沖液洗片5 min，洗去多余雜交液；滴加DAPI復(fù)染劑，熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。檢測前須通過HE片定位腫瘤浸潤區(qū)域。

1.3.2 IHC檢測ER、PR、Ki67、HER2蛋白表達所有標本均在VENTANA公司全自動免疫組織化學（免疫組化）染色機上進行ER、PR、Ki67、HER2蛋白檢測，具體操作步驟嚴格按羅氏診斷優(yōu)化程序執(zhí)行。

1.4 結(jié)果判讀

1.4.1TOP2A基因FISH檢測結(jié)果判讀具體方法參照文獻[11-12]。在60個浸潤區(qū)癌細胞核內(nèi)計數(shù)GSPTOP2A（紅色）和GSP17（綠色）信號，分別計數(shù)GSPTOP2A和GSP17的信號總數(shù)，再計算GSPTOP2A和GSP17比率，當TOP2A信號呈簇狀或比值≥2.0判定為基因擴增；比值＜0.8判定為基因缺失；比值在0.8～2.0之間判定為基因無擴增或缺失；當比值在0.7～0.9或1.8～2.2時，需換人增加計數(shù)細胞重新計算比值。

1.4.2 免疫組化參照乳腺癌HER2檢測指南（2014版），均以浸潤癌細胞為觀察目標，無著色或≤10%癌細胞微弱膜著色為（0）；≥10%癌細胞微弱膜著色為弱陽性（+）；10%癌細胞不完整和（或）中等強度膜著色；或≤10%癌細胞強而完整的膜著色為陽性（++）；＞10%癌細胞強而完整的膜著色為強陽性（+++）。ER、PR以1%為標準，≥1%即為陽性，＜1%為陰性；Ki67以20%、50%為分界點，＜20%為低表達，20%～50%為中表達，＞50%為高表達。

1.4.3 組織學分級根據(jù)腺管形成的程度（有多數(shù)腺管為1分，有中度分化腺管為2分，細胞呈實性片塊或條索狀生長為3分）、細胞核的多形性（細胞核大小、形狀及染色質(zhì)一致為1分，細胞核中度不規(guī)則為2分，細胞核明顯多形性為3分）及核分裂（1/10HPF為1分，2～3/10HPF為2分，＞3/10HPF為3分）計數(shù)進行統(tǒng)計，3～5分為I級（分化好），6～7分為Ⅱ級（中等分化），8～9分為Ⅲ級（分化差）。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A基因異常與臨床病理特征的關(guān)系

371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中TOP2A基因擴增64例，占17.25%；缺失12例，占3.24%，總異常率20.49%（76/371），無擴增或缺失295例，占79.52%（見圖1）。TOP2A基因狀態(tài)與年齡、部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），性別組男性的異常率高于女性，但例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；病理組織學分級中，Ⅰ級異常率最低，僅為3.03%，Ⅱ級異常率為20.49%，Ⅲ級異常率最高為30.90%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TOP2A基因異常中伴有高級別導(dǎo)管原位癌的病例占18.42%，高于伴中低級別導(dǎo)管原位癌的病例，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），腫瘤在2～5 cm時TOP2A擴增和缺失比率較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 TOP2A基因狀態(tài)與ER、PR、Ki67、HER2蛋白表達異常的相關(guān)性

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中ER、PR的陽性表達均高于陰性，但與TOP2A基因狀態(tài)無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Ki67陰性或＜20%，TOP2A基因異常率為8.33%，Ki67表達在20%～50%，TOP2A基因異常率為41.67%，KI-67表達＞50%，TOP2A基因異常率為55.56%（見圖2），發(fā)現(xiàn)TOP2A基因擴增隨著Ki67表達增強而增高，但TOP2A基因缺失在Ki67蛋白表達20%～50%時異常率較高（75%），HER2蛋白表達+/++/+++（見圖3），TOP2A基因異常率分別為8.33%、22.22%和75.00%，HER2蛋白表達越強TOP2A基因異常率越高。見表2。

圖1 TOP2A基因表達情況 （100×1.30oil）

表1 TOP2A基因與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

續(xù)表1

圖2 Ki67蛋白不同表達水平 （×100）

圖3 HER2蛋白不同表達水平

表2 TOP2A基因突變與ER、PR、KI-67、HER-2蛋白表達異常的相關(guān)性 例（%）

續(xù)表2

3 討論

TOP2A基因編碼DNA拓撲異構(gòu)酶IIα，是核基質(zhì)成分之一，在核內(nèi)發(fā)揮作用[9]。TOP2A作為調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動態(tài)變化、控制核酸生理功能的一種關(guān)鍵酶，在多種細胞的酶類中均有存在，且在增殖細胞中呈現(xiàn)有周期特異性表達。TOP2A在腫瘤增殖的不同細胞周期中表達各異，一般表現(xiàn)為在DNA 復(fù)制后期及有絲分裂期延長，有絲分裂期結(jié)束后表達有所下降，提示腫瘤增殖受TOP2A表達的影響[10]。TOP2A基因參與乳腺癌細胞的復(fù)制，存在TOP2A基因異常的患者預(yù)后差，無復(fù)發(fā)生存期縮短，尤其是TOP2A基因缺失的患者預(yù)后更差。TOP2A基因擴增提示腫瘤有復(fù)發(fā)的可能，或者遠期的療效降低。因此正確檢測和評定乳腺癌的TOP2A狀態(tài)至關(guān)重要。而且TOP2A是蒽環(huán)類抗生素的靶酶，TOP2A基因的擴增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)及其藥效[11-12]，國外有文獻報道，乳腺癌TOP2A基因擴增23.9%，基因缺失2.8%[13]，國內(nèi)文獻報道TOP2A基因擴增12.6%～19.0%，未見有缺失報道[14-16]。本研究對371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者通過FISH方法進行TOP2A基因檢測，基因異常率為20.49%（76/371），其中擴增64例（17.25%），缺失12例（3.24%），與國內(nèi)外文獻報道基本相符，在與臨床病理特征的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，TOP2A基因改變與年齡、性別和部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)，男性乳腺癌的異常率雖然高于女性，但無差異，可能是由于樣本例數(shù)較少，還有待于積累病例數(shù)進一步明確。浸潤性導(dǎo)管癌組織學分級分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，分級越高，腫瘤細胞分化程度越差，TOP2A基因異常率就越高，而且腫瘤在2～5 cm時TOP2A擴增和缺失比率較高。在統(tǒng)計中還發(fā)現(xiàn)，浸潤性導(dǎo)管癌中約48.27%TOP2A基因改變伴有不同分化程度的原位癌，以高級別原位癌為主，筆者認為這可能是腫瘤在從原位癌發(fā)展為浸潤癌的過程中細胞增殖比較活躍導(dǎo)致異常率增高的原因。ER、PR、HER2、Ki67的檢測結(jié)果是分子分型的重要參考，ER、PR是調(diào)節(jié)性器官細胞生長發(fā)育的雌激素和孕激素受體，是類固醇激素受體超家族成員之一，以往研究發(fā)現(xiàn)，ER陽性乳腺癌細胞一般分化好，發(fā)展慢；ER陰性的細胞則分化差，惡性程度高。PR是雌激素與ER結(jié)合的衍生物。據(jù)研究顯示，PR陽性表達者無瘤生存期長于PR陰性表達者[17]。本研究中顯示，在TOP2A基因擴增、缺失和無異常的浸潤性導(dǎo)管癌中ER、PR的陽性表達均高于陰性，對于TOP2A基因狀態(tài)無差異，Ki67是一種與細胞增殖周期有關(guān)，參與DNA合成的蛋白質(zhì)，目前，Ki67已成為檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標。有研究表明，Ki67的表達與腫瘤分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TOP2A基因擴增隨著Ki67表達增強而增高，TOP2A基因缺失在Ki67蛋白20%～50%表達范圍突變率較高。TTOP2A基因和HER2/neu原癌基因在染色體上均定位于17q11.2～22區(qū)域，并且與HER2基因相隔很近，有研究表明，HER2與TOP2A在乳腺癌中的表達存在一定相關(guān)性且共同影響其發(fā)生、發(fā)展[18]，本研究結(jié)果顯示，HER2蛋白表達越強TOP2A基因異常率越高。文獻報道，TOP2A基因異常與非特殊性浸潤性乳腺癌的分級、HER2基因擴增以及Ki67蛋白表達存在正相關(guān)[19]，也有文獻報道TOP2A基因擴增與Ki67及病理分級無關(guān)聯(lián)[16，20]，本研究在這4種蛋白表達中，TOP2A基因異常與ER、PR蛋白表達無相關(guān)性，與HER2、Ki67蛋白表達呈正相關(guān)，蛋白表達越強異常率越高，各實驗室研究報道不同，這可能與實驗室標準、免疫組化的判讀和分型比例及人為因素的差異有關(guān)，有待于進一步探討。

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因及相關(guān)蛋白的表達存在復(fù)雜性，但已成為乳腺癌治療和預(yù)測的重要指標，TOP2A基因擴增及蛋白過表達可能增加乳腺癌細胞對蒽環(huán)類化療藥物敏感性[21]。因此，TOP2A基因檢測是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌蒽環(huán)類藥物使用的重要依據(jù)和必要檢測手段。目前關(guān)于TOP2A基因狀態(tài)的報道較少，有待于進一步的研究和總結(jié)。

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