舒耀，吳斌，宋俊

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 乳腺外科，四川 瀘州 646000）

乳腺癌（breast cancer，BC）是全球婦女中最常見的癌癥，BC的早期診斷對于提高患者的生存率及生活質(zhì)量至關(guān)重要。乳腺鉬靶和超聲成像被廣泛用于BC的篩查，但乳腺攝影術(shù)中乳房密度增加會降低檢查的敏感性，鉬靶的陽性檢出率并不高[1]。兩種基于血清的腫瘤生物標(biāo)志物（CA15-3和CEA）用于檢測BC，但敏感性和特異性有限[2]。因此新型和更準(zhǔn)確的無創(chuàng)生物診斷標(biāo)志物引起人們的關(guān)注。到目前為止，研究已經(jīng)證明微小RNA（miRNA）不僅在腫瘤組織中異常表達(dá)，也會在外周血中穩(wěn)定存在，其可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物[3]。本研究對48例BC患者進(jìn)行血清miRNA-210、miRNA-21和miRNA-1246水平檢測，分析其與BC發(fā)病的關(guān)系及診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月-2017年6月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科確診的女性BC患者48例（BC組）。年齡34～69歲，中位52歲；絕經(jīng)前患者20例（41.7%），絕經(jīng)后28例（58.3%）；非浸潤性癌6例（12.5%），浸潤性癌42例（87.5%）；腫瘤直徑小于2 cm者15例（31.3%），直徑2～5 cm者33例（68.7%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例（27.1%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例（72.9%）；TNM分期（UICC第7版）：0期15例（31.3%），Ⅰ期9例（18.8%），Ⅱ期14例（29.2%），Ⅲ期10例（20.8%）。入選標(biāo)準(zhǔn)：①所有病例均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為BC；②具備完整的臨床資料；③取得標(biāo)本前均未接受過新輔助治療；④既往無腫瘤病史且無其他部位轉(zhuǎn)移的BC患者。

正常對照組為同一時期進(jìn)行年度體檢的健康女性48例（對照組）。年齡37～68歲，中位53歲。兩組患者在年齡、體重指數(shù)、哺乳史及月經(jīng)史等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者均知曉本研究目的、過程和意義，并同意參與，簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑

1.2.1 標(biāo)本采集BC患者于手術(shù)前1天抽取清晨空腹靜脈血6 ml、對照組受試者體檢的當(dāng)日（空腹10 h以上）采集其肘靜脈血6 ml（含促凝膠的真空采血管），室溫靜置30 min～1 h，血液凝固后取上清于潔凈1.5 ml EP管，置入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 試劑血清miRNA提取試劑（10% PEG試劑、lysis buffer），探針及引物設(shè)計（美國Applied Biosyste公司），Rever Tra Ace qRT-PCR Kit，THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（東洋坊上?？萍忌镉邢薰荆?。

1.2.3 儀器與設(shè)備ABI-7500熒光定量PCR儀（ABI公司、美國），離心機(jī)（Eppendorf、德國），37℃水浴鍋、95℃金屬浴鍋（北京田園奧瑞生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取將血清樣本置入離心機(jī)中4℃5 000 r/min離心30 min，取400 μl上層血清于潔凈1.5 ml EP管中，加入44 μl 10% PEG試劑，于4℃冰箱靜置沉淀2 h，再于離心機(jī)4℃ 5 000 r/min離心10 min，得到的沉淀用400 μl檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH=4.5）沖洗3次，再次于離心機(jī)中4℃ 5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，往剩余的沉淀中加入20 μl lysis buffer溶液。

1.3.2 cDNA合成嚴(yán)格按照Rever Tra ACE qRTPCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系：RNA模板 5 μl，引物 miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246、U6 各 1 μl，Enzyme Mix 1 μl、5×Buffer 4 μl、DEPC水6 μl。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃水浴箱中2 h，待轉(zhuǎn)錄結(jié)束后再置于95℃金屬浴中5 min，然后立即置于冰盒上。

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-timepolymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測以熒光定量PCR儀使用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以U6為內(nèi)參檢測目的基因相對表達(dá)水平，U6、miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246引物序列見表1。反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物2 μl，2×miRNA qPCR Mix 10 μl，20× 引物各 1 μl，余用MQ水補(bǔ)齊至20 μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40個循環(huán)，所有反應(yīng)設(shè)立2個復(fù)孔。根據(jù)各樣品qRT-PCR曲線得到Ct值，Ct值表示熒光達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)。miR-21/210/1246在乳腺癌患者血清中的相對表達(dá)量用2-△△Ct描述，△△ Ct=（CtmiR-21/210/1246-CtU6）乳腺癌-（CtmiR-21/210/1246-CtU6）對照組。

表1 引物序列

1.4 評判標(biāo)準(zhǔn)

ROC曲線下面積值1.0～0.5。在AUC＞0.5的情況下，AUC越接近于1，說明診斷效果越好。0.5＜AUC＜0.7時有較低準(zhǔn)確性；0.7≤AUC≤0.9時有一定準(zhǔn)確性，AUC＞0.9以上時有較高準(zhǔn)確性。AUC=0.5時，說明診斷方法完全不起作用，無診斷價值。約登指數(shù)（youden index，YI）表示診斷試驗（或某一種檢測方法）發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力；約登指數(shù)=敏感性+特異性-1，其值于0～1之間波動，其值愈大，說明該診斷試驗（檢測方法）的真實(shí)性越好且更穩(wěn)定，其診斷價值越高。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0和MedCalc統(tǒng)計軟件，定性資料用頻數(shù)及百分率表示，定量資料用中位數(shù)及其四分位數(shù)間距表示，采用秩和檢驗，利用ROC曲線確定不同指標(biāo)對BC的診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。BC的最佳診斷模型由Fisher判別分析建立。

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246的表達(dá)水平

BC組患者血清miRNA-21的相對表達(dá)水平為0.591（0.340，1.022），對照組相對表達(dá)水平為0.145（0.078，0.193）（Z=-7.108，P =0.001）。BC組患者血清miRNA-210的相對表達(dá)水平為1.187（0.411，2.043），對照組相對表達(dá)水平為0.060（0.032，0.100）（Z=-8.112，P =0.000）。BC組患者血清miRNA-1246的相對表達(dá)水平為109.758（33.201，282.513），對照組相對表達(dá)水平為36.383（18.777，65.918）（Z=-4.008，P =0.000）。miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246 3 者在BC組患者血清中的表達(dá)水平均升高。

2.2 血清 miRNA-210、miRNA1246、miRNA-21水平與BC患者臨床特征的關(guān)系

血清miRNA-210、miRNA-1246、miRNA-21在Ⅲ期BC患者或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中高表達(dá)（P＜0.05），而與絕經(jīng)狀況、腫瘤大小及病理類型無關(guān)系（P＞0.05）。見表2。

2.3 血清miRNA在BC診斷中的ROC曲線分析

通過ROC曲線分析顯示，miRNA-210曲線下面 積（AUC） 為 0.980（95%CI：0.928，0.998）， 敏感性為 95.80%（95%CI：0.857，0.995），特異性為91.70%（95%CI：0.800，0.977），約登指數(shù)為0.875；miRNA-21的 AUC 為 0.936（95%CI：0.866，0.976），敏感性為89.60%（95%CI：0.773，0.965），特異性為85.40%（95%CI：0.722，0.939），約登指數(shù)為0.750；miRNA-1246 的 AUC 為 0.737（95%CI：0.638，0.822），敏感性為 58.30%（95%CI：0.432，0.724），特異性為89.60%（95%CI：0.773，0.965），約登指數(shù)為0.479。提 示 miRNA-210、miRNA-21、miRNA-1246對 BC均有一定診斷效能。而AUC miRNA-21+miRNA-210+miRNA-1246=AUC miRNA-210+miRNA-1246＞AUC miRNA-21+miRNA-210＞AUC miRNA-21+miRNA-1246。AUC miRNA-210+miRNA-1246 vs AUC miRNA-210，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.332，P=0.183），也就是說miRNA-210+miRNA-1246聯(lián)合檢測、miRNA-21+miRNA-210+miRNA-1246聯(lián)合檢測的診斷效能并不優(yōu)于miRNA-210單獨(dú)檢測。見表3和圖1。

表2 BC患者血清miRNA-210、miRNA-1246、miRNA-21表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

續(xù)表2

2.4 BC診斷模型的建立

Fisher判別分析用于建立BC的最佳診斷模型，其中進(jìn)入F=3.84，移除F=2.71，得到：miRNA-21（a1）、miRNA-210（a2）、miRNA-1246（a3）的判別方程系數(shù)，見表4和圖2。

表3 不同指標(biāo)或指標(biāo)組合的診斷價值比較 （n =48）

即，當(dāng)將患者上述參數(shù)（a1～a3）分別帶入方程Q1、Q2，當(dāng)Q1＞Q2時，認(rèn)為該患者應(yīng)歸為對照組（正常組）；當(dāng)Q1＜Q2時，認(rèn)為該患者應(yīng)歸為病例組，應(yīng)對該患者做進(jìn)一步的篩查與核實(shí)。

應(yīng)用該模型對本樣本進(jìn)行回代判別，結(jié)果顯示：本判別模型的敏感性為62.5%；特異性為100.0%，即該模型排除非患者的能力較好，而發(fā)現(xiàn)患者的能力相對較弱，見表5。

圖1 不同指標(biāo)的診斷價值比較

表4 分類函數(shù)系數(shù) （未標(biāo)準(zhǔn)化）

圖2 判別分析對BC診斷的效果圖

表5 判別模型的分類結(jié)果

3 討論

miRNA是21～25個核苷酸組成的非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平上以序列特異性方式負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。每個miRNA通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合以誘導(dǎo)信號降解或抑制翻譯來控制多個靶基因的表達(dá)。miRNA表達(dá)可以對細(xì)胞表型和功能產(chǎn)生重要的影響[4]。許多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤的發(fā)展，侵襲，轉(zhuǎn)移和其他特征密切相關(guān)，表明miRNA有可能成為癌癥治療新策略的基礎(chǔ)[5]。CHEN等[6-7]將各種來源的血清miRNA在惡劣條件下進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)煮沸、低/高pH，RNA降解酶、反復(fù)凍融或延長儲存時間等方法均不會造成miRNA的損失，進(jìn)一步證實(shí)血清miRNA的穩(wěn)定性，其具備作為疾病分子生物標(biāo)志物的許多優(yōu)點(diǎn)。幾項研究已經(jīng)評估血清或血漿miRNA作為不同類型癌癥的生物標(biāo)志物的潛在用途，如肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌、舌鱗狀細(xì)胞癌及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤[8-13]。

miRNA-21在大多數(shù)人類腫瘤中表達(dá)，已被證明是致癌過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤形成和進(jìn)展中起重要作用。IORIO等[14]報道m(xù)iRNA-21在BC組織中過表達(dá)，可能是BC有用標(biāo)記。WANG等[15]使用qRTPCR測定結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞系中miRNA-1246的miRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-1246在腫瘤組織中的表達(dá)水平高于成對的相鄰組織。此外，SW620、SW480、HCT116、HT29和LOVO細(xì)胞系中miRNA-1246的表達(dá)水平也比正常腸上皮細(xì)胞高，結(jié)果提示miRNA-1246可能參與結(jié)直腸癌的形成和進(jìn)展，其可能具有促癌基因的作用。位于染色體11p15.5上的miRNA-210在許多人類癌癥中過表達(dá)[16-18]。miRNA-210過度表達(dá)，特別是在缺氧條件下，影響涉及腫瘤發(fā)展的許多過程，包括促進(jìn)血管生成和DNA修復(fù)能力的降低[17，19]。尿路上皮細(xì)胞癌（UTUC）組織中miRNA-210表達(dá)高于非癌性尿路上皮細(xì)胞，且miRNA-210表達(dá)水平與腫瘤分期和組織學(xué)分級正相關(guān)，這提示miRNA-210可能是UTUC的重要致癌因子[20]。本研究均證明，惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展與miRNA表達(dá)失衡有關(guān)。但是通過活檢或手術(shù)取得標(biāo)本是1個有創(chuàng)過程，容易引起鄰近組織損傷或癌癥轉(zhuǎn)移。

YING等[21]研究證實(shí)miRNA-210過表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。ROTKRUA等[22]發(fā)現(xiàn)，miRNA-210的血清水平在彌漫性胃癌的小鼠模型中高于對照組。YU等[23]提出miRNA-210可能是早期檢測胃癌的可靠標(biāo)志物。HENEGHAN等[24]發(fā)現(xiàn)在148例BC患者的循環(huán)血中，miRNA-195和let-7a的水平較正常對照組高，腫瘤切除后降低至與對照組相當(dāng)?shù)乃?。上述研究表明，血清miRNA的檢測可以作為癌癥無創(chuàng)診斷的潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，BC組患者的水平高于對照組（P＜0.001），提示3者在BC患者中可能發(fā)揮促癌基因的作用，其血清水平過表達(dá)可能是BC診斷的潛在生物標(biāo)志物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BC患者miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246血清水平與臨床特征相關(guān)，3者在BCⅢ期患者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者高表達(dá)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246不但參與BC發(fā)病，還可能與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。WANG等[25]發(fā)現(xiàn)miRNA-21在BC患者血清中增高（P＜0.001）。CHEN等[26]提出BC患者血清miRNA-21高表達(dá)不僅與BC的發(fā)生有關(guān)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。YAN等[27]研究表明，miRNA-21的過表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差相關(guān)。上述3個研究結(jié)論與本文結(jié)果一致。

為進(jìn)一步評估血清miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246對BC診斷的價值，本研究分別對3者做ROC曲線分析，結(jié)果顯示，miRNA-210+miRNA-1246聯(lián)合檢測、miRNA-21+miRNA-210+miRNA-1246聯(lián)合檢測的診斷效果并不優(yōu)于miRNA-210單獨(dú)檢測。Fisher判別分析用于建立BC的最佳診斷模型，該模型的敏感性為62.5%；特異性為100.0%，即排除非患者的能力較好，而發(fā)現(xiàn)患者的能力相對較弱。故miRNA-210可能是一種理想的BC診斷標(biāo)志物。

綜上所述，BC患者血清miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246水平呈高表達(dá)狀態(tài)，對BC有一定的診斷價值，miRNA-210對BC的診斷價值可能最高。3者與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)系。本研究存在樣本量小，僅對比BC患者和健康組血清miRNA的表達(dá)水平，未深入研究多種因素如手術(shù)、化療等對血清中miRNA的影響。將在后續(xù)的研究中開展相應(yīng)的工作。

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