王曉婧，喬夢(mèng)婷

（1.北京大學(xué)第三醫(yī)院 口腔科,北京 100091；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院口腔修復(fù)科，北京 100012）

種植體周圍炎是一種累及種植體周圍軟硬組織的慢性炎癥性疾病，主要特征是探診出血以及漸進(jìn)性的種植體周圍骨吸收水平[1]。如果未能及時(shí)治療，種植體周圍炎可能會(huì)形成種植體周袋，進(jìn)而種植體松動(dòng)，甚至脫落，最終導(dǎo)致種植失敗。據(jù)報(bào)道，種植體的周圍炎的發(fā)生率大概是10%～45%[2]。種植體周圍炎的治療原則是去除菌斑，控制感染，目前常規(guī)使用的治療方法包括局部清創(chuàng)、藥物或手術(shù)治療等不能徹底預(yù)防和控制種植體周圍炎的發(fā)生，因此種植體周圍炎仍然是長(zhǎng)期困擾臨床種植醫(yī)生的術(shù)后并發(fā)癥之一[3]。

細(xì)菌生物膜在種植體周圍炎的發(fā)生、發(fā)展中起決定性作用，實(shí)際上，種植體周圍炎與牙周炎齦下菌斑的菌群類似[4]。近年來(lái)，許多學(xué)者開始關(guān)注并試圖尋找一種合適的種植體表面涂料具有抑制種植體表面細(xì)菌定植的能力[5-6]。銀及其化合物具有良好的殺菌、消炎性能，通過(guò)破壞DNA結(jié)構(gòu)從而廣譜抑制革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的生長(zhǎng)，適當(dāng)劑量下未觀察到無(wú)細(xì)胞毒性[7-8]。硅烷偶聯(lián)劑由于其無(wú)毒性、無(wú)污染、適用廣泛、對(duì)有機(jī)涂層黏結(jié)性能優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)逐步受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中鈦表面進(jìn)行硅烷處理可以減少細(xì)菌黏附和生物膜的形成[9]。本實(shí)驗(yàn)擬采用未處理的Ti種植體、Ti-Ag種植體（鍍銀處理）、Ti-Si種植體（表面硅烷膜）觀察在體內(nèi)不同的抗菌涂層對(duì)種植體周圍炎骨吸收的影響。

1 材料與方法

1.1 種植體表面涂層制取與檢測(cè)

30枚圓柱狀醫(yī)用級(jí)純鈦棒（直徑3.5 mm，長(zhǎng)度8 mm）（購(gòu)自格瑞集團(tuán)寶雞分公司），隨機(jī)分為3組。Ti-Ag組：銀電沉積處理；Ti-Si組：硅烷化處理；Ti組：未進(jìn)行處理（對(duì)照組）。鍍銀處理主要是利用電化學(xué)沉積（electrochemically deposition）的陰極沉積法，通過(guò)還原硝酸銀制得納米銀膠體溶液，通過(guò)電沉積在純鈦表面制備納米亞晶狀銀的涂層材料。硅烷化處理首先對(duì)純鈦表面進(jìn)行堿洗處理，再通過(guò)KH-550硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行硅烷化改性處理從而在表面構(gòu)建過(guò)渡層[10]。

1.2 動(dòng)物準(zhǔn)備與手術(shù)過(guò)程

雄性Beagle純種犬30只，2歲齡，牙周健康，體重10～13 kg（購(gòu)自陜西省西安市迪樂(lè)普比格犬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心基地），確認(rèn)所有動(dòng)物下頜骨無(wú)明顯異常，無(wú)明顯咬合創(chuàng)傷，無(wú)病毒或真菌感染，無(wú)系統(tǒng)性疾病。種植體植入過(guò)程大致如下：術(shù)前禁食12 h后肢肌內(nèi)注射30 g/L戊巴比妥鈉（1 ml/kg）全身麻醉，消毒固定，拔除下頜雙側(cè)前磨牙并保護(hù)牙槽窩周圍骨壁的完整性，翻瓣并隨機(jī)植入6枚種植體，初期穩(wěn)定性35 Nm。共植入30枚種植體，其中10枚Ti-Ag種植體，10枚Ti-Si種植體，10枚Ti種植體（對(duì)照組）。縫合創(chuàng)口，并用4-0絲線在種植體頸部進(jìn)行結(jié)扎，壓入齦溝內(nèi)，并高糖軟食喂養(yǎng)誘導(dǎo)種植體周圍炎模型。

1.3 臨床指標(biāo)檢測(cè)

種植體周圍炎誘導(dǎo)2個(gè)月后，檢測(cè)臨床指標(biāo)檢測(cè)包括菌斑指數(shù)（plaque index，PI），改良齦溝出血指數(shù)（modified sulcus bleeding index，mSBI），探診深度（probing depth，PD），牙齦指數(shù)（Gingival index，GI），種植體松動(dòng)度（mobility，MOB）[11-12]。

臨床指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。①PI：0為無(wú)菌斑；1：探針尖輕劃過(guò)種植體表面可見(jiàn)菌斑；2：肉眼可見(jiàn)菌斑；3：大量軟垢。②mSBI：探診種植體周圍軟組織邊緣發(fā)現(xiàn)：0為沒(méi)有出血點(diǎn)，1為可見(jiàn)個(gè)別出血點(diǎn)，2為軟組織邊緣呈線狀出血，3重度出血或自發(fā)出血。③PD：以0.2 N的力（約20 g）探測(cè)齦緣到牙周袋底的距離（mm）。④GI：0為為正常牙齦；1為牙齦略有水腫，探針不出血；2為牙齦水腫，探針探之出血；3自發(fā)出血或潰瘍形成。⑤MOB：按照Periotest動(dòng)度儀說(shuō)明書操作，手柄垂直于種植體頰舌向放置，數(shù)值范圍-8～50，其中-8～+9為生理動(dòng)度，數(shù)值越大松動(dòng)度越大。

1.4 影像學(xué)檢查

術(shù)后種植體周圍炎誘導(dǎo)2個(gè)月后，對(duì)所有種植體拍攝根尖X射線片，觀察種植體周圍的骨質(zhì)情況。使用圖像分析軟件（Image J），以種植體基臺(tái)水平作為參考點(diǎn)進(jìn)行校準(zhǔn)，測(cè)量每個(gè)種植體的骨吸收水平并取平均值。

1.5 抗拔實(shí)驗(yàn)（pull-out test）

制取生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：修整種植體周圍牙槽骨，使種植體高出骨面2 mm，使用自凝塑料包埋種植體-骨塊，置于微機(jī)控制電子萬(wàn)能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上（CMT4000，位移分辨率0.03 μm），以1 mm/min速度拉出測(cè)試，記錄種植體開始松動(dòng)時(shí)的最大載荷值，并計(jì)算種植體-骨界面結(jié)合強(qiáng)度值（σ），計(jì)算公式為σ=P/（πdh），其中P為種植體開始松動(dòng)時(shí)的最大載荷值（N）；d為種植體的直徑（mm）；h為種植體在骨內(nèi)的長(zhǎng)度（mm）。

1.6 組織學(xué)分析

制備種植體-骨標(biāo)本的組織切片，大致步驟如下：4%多聚甲醛固定，酒精脫水，二甲苯透明，滲透液浸泡，包埋，聚合，置入-20℃冰箱冷凍后切片，進(jìn)行Goldner's Trichrome染色[13]。

倒置相差顯微鏡下觀察組織切片，放大100倍拍照。使用圖像分析軟件（Image J）進(jìn)行定量分析，計(jì)算骨-種植體接觸率（Bone-Implant Contact，BIC%）=骨組織直接接觸的種植體表面積/種植體可利用的表面積×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用Bonforroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 種植體的臨床檢查情況

種植體周圍炎誘導(dǎo)2個(gè)月后，所有實(shí)驗(yàn)犬身體及精神狀態(tài)良好，進(jìn)食正常。口內(nèi)可見(jiàn)所有種植體均在原位，無(wú)一脫落。Ti-Ag和Ti-Si組僅可見(jiàn)種植體周圍黏膜有輕到中度水腫，叩診聲音清脆，無(wú)松動(dòng)；對(duì)照組種植體周圍黏膜水腫，甚至出現(xiàn)破潰、膿液溢出，叩診聲音渾濁，個(gè)別種植體臨床可見(jiàn)松動(dòng)。

對(duì)口內(nèi)各個(gè)種植體進(jìn)行臨床指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)Ti-Ag和 Ti-Si組各檢查指標(biāo)（PI、mSBI、PD、GI、MOB）優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Ti-Ag和Ti-Si組間各檢驗(yàn)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的比較 （±s）

表1 各組臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的比較 （±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別 PI mSBI PD/mm GI MOB Ti-Ag組 1.923±0.531? 1.314±0.223? 3.653±0.362? 1.303±0.409? -1.881±0.577?Ti-Si組 1.918±0.472? 1.295±0.230? 3.301±0.360? 1.351±0.427? -1.746±0.463?對(duì)照組 2.928±0.463 2.780±0.332 4.598±0.411 2.760±0.310 5.653±0.441 F值 10.713 12.563 6.428 12.423 15.968 P值 0.004 0.001 0.023 0.001 0.001

2.2 X射線檢查結(jié)果及定量分析

種植體周圍炎誘導(dǎo)2個(gè)月后，可見(jiàn)Ti-Ag和Ti-Si組種植體周圍骨密度無(wú)吸收，骨密度均勻致密；而對(duì)照組X射線結(jié)果顯示周圍牙槽骨呈垂直吸收，種植體與骨組織間可見(jiàn)透射狀影像，見(jiàn)圖1。對(duì)X射線結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果可見(jiàn)對(duì)照組的骨吸收量小于Ti-Ag和Ti-Si組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩實(shí)驗(yàn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 Pull-out test結(jié)果

通過(guò)pull-out test測(cè)量各組種植體-骨界面結(jié)合強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示，Ti-Ag和Ti-Si組的種植體-骨界面結(jié)合強(qiáng)度值分別為（2.460±0.577）和（2.772±0.613）MPa，兩者之間的種植體-骨結(jié)合強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)照組（1.841±0.542 MPa）的種植體-骨結(jié)合強(qiáng)度卻低于其余兩組（P＜0.01）。

圖1 3組種植體X射線結(jié)果

表2 各組X射線骨吸收量的比較 （mm，±s）

表2 各組X射線骨吸收量的比較 （mm，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別 骨吸收量 F值 P值Ti-Ag 1.943±0.302? 7.572 0.018 Ti-Si 1.867±0.234?對(duì)照組 3.129±0.461

表3 各組種植體-骨界面結(jié)合強(qiáng)度值的比較（MPa，±s）

表3 各組種植體-骨界面結(jié)合強(qiáng)度值的比較（MPa，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.01

組別 種植體-骨界面結(jié)合強(qiáng)度 F值 P值Ti-Ag 2.460±0.577? 9.884 0.006 Ti-Si 2.772±0.613?對(duì)照組 1.841±0.542

2.4 組織學(xué)結(jié)果

種植體周圍炎誘導(dǎo)2個(gè)月后，制備種植體-骨標(biāo)本的組織切片，Goldner's Trichrome染色結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)Ti-Ag和Ti-Si組較對(duì)照組具有更好的骨結(jié)合，種植體周圍被骨組織緊密包繞，而對(duì)照組與周圍骨組織結(jié)合較差，可見(jiàn)大量纖維結(jié)締組織充斥。

圖2 種植體-骨結(jié)合界面

通過(guò)組織形態(tài)學(xué)測(cè)量并計(jì)算BIC，可見(jiàn)Ti-Ag和Ti-Si組 的 BIC為（64.713±3.644）% 和（58.511±3.502）%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而對(duì)照組（30.657±4.297）%的BIC低于其余兩組（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 各組組織學(xué)切片骨吸收量的比較 （%，±s）

表4 各組組織學(xué)切片骨吸收量的比較 （%，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.01

組別 骨吸收量 F值 P值Ti-Ag 64.713±3.644? 13.082 0.001 Ti-Si 58.511±3.502?對(duì)照組 30.657±4.297

3 討論

自1966年Branmark教授揭示骨整合理論至今40余年間，種植修復(fù)已成為治療牙列缺損最常用的修復(fù)手段之一。種植牙具有與正常牙相似的結(jié)構(gòu)，可利用人工牙根進(jìn)行上部支持，具有咀嚼效率高、舒適美觀以及無(wú)需損傷鄰牙等多種優(yōu)點(diǎn)[14-15]。雖然據(jù)報(bào)道鈦種植體的10年成功率已達(dá)90%～95%[16]，但隨著種植手術(shù)適應(yīng)證的不斷擴(kuò)展和人們口腔要求的不斷提高，種植術(shù)后感染仍是口腔臨床醫(yī)生與研究學(xué)者不得不面對(duì)的重要問(wèn)題。

有研究表明，口腔內(nèi)細(xì)菌黏附聚集在種植體表面，并形成齦下菌斑是術(shù)后種植體周圍感染的重要原因[17-18]。由于種植體與骨之間沒(méi)有牙周膜的保護(hù)，導(dǎo)致種植體周圍炎癥迅速發(fā)展，種植體和周圍骨的結(jié)合遭到破壞，造成持續(xù)的骨喪失并影響新骨的形成，治療不及時(shí)或不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致種植體脫落，進(jìn)而導(dǎo)致種植治療的失敗。傳統(tǒng)的治療方法是局部使用抗生素（如鹽酸米諾環(huán)素、甲硝唑等），但往往會(huì)出現(xiàn)藥物持續(xù)時(shí)間難以控制、抗生素耐藥性或者患者難以配合等問(wèn)題。因此，種植體抗菌涂層的出現(xiàn)賦予了鈦種植體表面抗菌性能，為抑制細(xì)菌生物膜、預(yù)防種植術(shù)后感染提供新的思路。

種植體涂層通過(guò)改變種植體表面微觀形態(tài)和化學(xué)性質(zhì)在種植體-骨結(jié)合過(guò)程中扮演了重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)多種表面改性方法（如噴砂、酸蝕、堿熱法、注入或高能輻射技術(shù)等）都能提高種植體穩(wěn)定性和長(zhǎng)期成功率[19-20]，而抗菌特性的研究尚在初步階段。本實(shí)驗(yàn)選擇具有廣譜抗菌效果的鍍銀涂層和新型表面處理工藝的硅烷膜涂層，觀察這兩者在體內(nèi)對(duì)種植體周圍炎骨吸收的影響。前期有文獻(xiàn)報(bào)道鍍銀處理與硅烷膜處理種植體在體外均能減少口腔生物膜的形成，但體內(nèi)對(duì)種植體周圍炎骨吸收的影響尚不明確[9，21]。在本實(shí)驗(yàn)中，未進(jìn)行表面處理的純鈦種植體在絲線結(jié)扎2個(gè)月后出現(xiàn)一系列種植體周圍炎的癥狀，包括種植體周圍黏膜水腫，甚至破潰溢膿，部分種植體出現(xiàn)松動(dòng)。而Ti-Ag和Ti-Si組種植體術(shù)后愈合良好，黏膜輕度水腫，未見(jiàn)松動(dòng)，組織學(xué)染色可見(jiàn)種植體唄骨組織緊密包饒。由此可以判斷，兩種抗菌涂層可以預(yù)防并改善種植術(shù)后早期感染所致炎癥。并且Ti-Ag和Ti-Si組種植體臨床檢查指標(biāo)優(yōu)于對(duì)照組，X射線拍攝、Pull-out實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)染色同樣也得到了一致的結(jié)果，可見(jiàn)Ti-Ag和Ti-Si組的骨結(jié)合力優(yōu)于對(duì)照組。

雖然鍍銀材料的抗菌性能廣為受到認(rèn)可，但其可能的毒性問(wèn)題仍然需要得到重視：研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)釋放出的銀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大時(shí)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性[22-23]。因此，本課題組下一步擬檢測(cè)載銀抗菌涂層植入體內(nèi)后銀離子的釋放與溶解情況。另一方面，硅烷分子是具有兩種不同的反應(yīng)性基團(tuán)的特殊分子，將金屬鈦通過(guò)硅烷分子的活性氨基基團(tuán)與生物骨組織連接起來(lái)，同時(shí)還改善材料的生物相容性，從單純的機(jī)械鎖合轉(zhuǎn)變形成良好的鈦-組織界面[24]，可見(jiàn)硅烷膜是一種極有前途的種植體抗菌涂層。

綜上所述，Ti-Ag和Ti-Si抗菌涂層表面處理均可以減少種植體周圍炎引起的骨吸收，對(duì)術(shù)后早期感染的預(yù)防效果好，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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