劉根梅，簡茗琪，高 天

（韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

流感病毒可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。A型流感病毒可從野生和家養(yǎng)的溫血?jiǎng)游铮B和哺乳類）等廣泛分離到。2013年在我國華東地區(qū)出現(xiàn)的H7N9 亞型流感病毒（AIV），即為A型流感病毒，因其對公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅而受到廣泛關(guān)注。自2013年2月底在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)并確診以來，我國已經(jīng)歷5波流行。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，截至2017年10月26日，人感染H7N9亞型AIV累計(jì)報(bào)告病例數(shù)1 564例；2013 年 3 月至 2017 年 6 月，全國 （不含香港、澳門、臺(tái)灣地區(qū)） 報(bào)告人感染 H7N9 亞型AIV共計(jì)1 445 例，死亡 562 例，病死率為 38.9%［1-2］。人感染的H7N9流感病毒是新亞型流感病毒，為全球首次發(fā)生［3-5］。Li 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，82% 的患者有禽類接觸史，并且從患者體內(nèi)分離出的H7N9 病毒與活禽市場中家禽分離出的病毒株之間的基因序列非常接近。Chen等［7］在活禽市場采集的家禽標(biāo)本中分離到 H7N9 禽流感病毒，這些分離株與從患者身上分離到的病毒株高度同源。在新型H7N9 流感病毒的8 個(gè)基因片段中，H7 片段來源于浙江鴨群中分離的禽流感病毒，并可追溯至東亞地區(qū)野鳥中分離的相似病毒；N9 片段與東亞地區(qū)野鳥中分離的禽流感病毒同源；其余 6 個(gè)基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）則來源于 H9N2 禽流感病毒［8-9］。

在養(yǎng)禽業(yè)方面，雖然H7N9病毒弱毒株對家禽無致病性，但給我國養(yǎng)禽業(yè)（主要是雞）造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2013 年以來，我國獸醫(yī)主管部門制定了嚴(yán)格的 H7N9 流感防控措施，但并沒有完全遏制 H7N9 病毒的擴(kuò)散和傳播。目前已在多個(gè)省市的活禽交易市場和部分省市的養(yǎng)殖場分離到 H7N9 病毒［10］。更重要的是，H7N9 病毒已經(jīng)發(fā)生基因突變，由原來對家禽無致病力病毒株變?yōu)楦咧虏⌒圆《局辏?1］。因此，建立 H7N9 亞型流感病毒的快速檢測方法顯得十分必要。其中，分子生物學(xué)技術(shù)因其具有快速、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于 H7N9 流感病毒核酸檢測，是目前眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。本研究建立了一種能同時(shí)鑒別 H7 亞型、N9 亞型的三重 PCR方法，并對該方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在韶關(guān)學(xué)院英東動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室完成。H7N9 亞型流感病毒模板、pMD-NA、pMDHA及pMD-M重組載體由中山大學(xué)惠贈(zèng)，H1N1流感病毒模板、H9N2 流感病毒模板、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）由本實(shí)驗(yàn)保存。

主要試劑：QIAamp Viral RNA Mini Kit ，購自 Qiagen 公司；PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit、Takara Taq? （with Mg2+free Buffer）、DL2000 DNA Marker，均購自 Takara 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 從 NCBI下載甲型流感病毒及H7N9 亞型流感病毒的多條基因序列，用DNAman 軟件對其進(jìn)行同源性比較，確定H7亞型AIV HA基因、N9亞型AIV NA基因以及所有亞型AIV M基因的保守序列，設(shè)計(jì)出能檢測H7亞型AIV、N9亞型AIV以及所有亞型AIV的3對特異性引物，通過NCBI Blast驗(yàn)證保證每對引物擴(kuò)增出對應(yīng)的病毒，不與其他病毒交叉。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物靶基因、引物名稱、引物序列和擴(kuò)增片段大小如表1所示。

表1 引物序列信息

1.2.2 病毒RNA的提取 根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明書抽提病毒RNA。利用 PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：50 μmol/L Random 6 mers 1 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，5×PrimeScript II Buffer 4 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，200 U/μL PrimeScript II RTase 1 μL，模板 RNA 1 μg，RNase Free水補(bǔ)齊至 20 μL。

1.2.3 單重PCR 擴(kuò)增 以cDNA為模板，用引物對H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL：TaKaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，10×PCR Buffer （Mg2+free）5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L） 4 μL，模板小于 500 ng，上下游引物濃度為0.2 μmol/L，滅菌水補(bǔ)齊至 50 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃ 2 min；94℃ 30 s、50.2～60℃ 30 s、72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。其中最佳退火溫度由梯度PCR確定，退火溫度分別設(shè)置為50.2、51.5、52.6、54.0、57.2、59.2、60.0℃，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 三重PCR檢測方法的建立及優(yōu)化 以cDNA為模板，用引物對H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。分別對退火溫度、引物濃度、dNTP Mixture濃度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。

最適退火溫度的確立：分別以50.2、51.5、52.6、54.0、57.2、59.2、60.0℃的退火溫度進(jìn)行梯度 PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，根據(jù)不同退火溫度下目的條帶的亮度確定最適退火溫度。

最適引物濃度的確立：設(shè)置上、下游引物終濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol/L進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定最適引物濃度。

最適dNTP Mixture濃度的確立：設(shè)置dNTP Mixture濃度分別為 50、100、150、200、250、300、350 μmol/L進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定最適dNTP Mixture濃度。

最適Mg2+濃度的確立：設(shè)置Mg2+濃度分別為 0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mmol/L進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定最適Mg2+濃度。

1.2.5 三重PCR方法特異性試驗(yàn) 以H1N1、H9N2、NDV、IBV等常見病毒cDNA為模板，利用優(yōu)化的三重PCR 方法分別進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.2.6 三重PCR方法敏感性試驗(yàn) 將pMDNA、pMD-HA及pMD-M重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，并利用優(yōu)化的三重PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)其敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 對韶關(guān)三鳥批發(fā)市場采集的470份咽肛拭子進(jìn)行三重PCR檢測。每10個(gè)拭子合并為1個(gè)樣品，加入PBS緩沖液，提取RNA進(jìn)行檢測。同時(shí)將備份的混樣樣品采用世紀(jì)元亨公司的禽流感病毒H7亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

提取H7N9 病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，用引物對H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳，分別獲得大小為304、160、458 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符。通過梯度PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明引物對H7-F/H7-R擴(kuò)增基因時(shí)的最佳退火溫度為59.2℃，引物對N9-F/N9-R擴(kuò)增基因時(shí)的最佳退火溫度為57.2℃，引物對M-F/M-R擴(kuò)增基因時(shí)的最佳退火溫度為57.2℃。

2.2 三重PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

對三重PCR退火溫度、引物濃度、dNTP Mixture濃度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。其中通過溫度梯度PCR擴(kuò)增，摸索最佳退火溫度，結(jié)果見圖1，退火溫度為59.2℃時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰，確定其為最佳退火溫度。通過PCR擴(kuò)增，摸索H7-F/H7-R引物對、N9-F/N9-R引物對、M-F/M-R引物對的最佳引物濃度，結(jié)果見圖2，H7-F/H7-R引物對濃度為0.6 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰，確定其為最佳引物濃度；N9-F/N9-R引物對濃度為0.2 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰，確定其為最佳引物濃度；M-F/M-R引物對濃度為0.3 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰，確定其為最佳引物濃度。結(jié)合上述優(yōu)化條件，設(shè)置dNTP Mixture濃度梯度，結(jié)果最佳dNTP Mixture濃度為250 μmol/L（圖3）；設(shè)置Mg2+濃度梯度，結(jié)果見圖4，在濃度為0.75 mmol/L 時(shí)幾乎沒有條帶，在 1.0 mmol/L 時(shí)開始出現(xiàn)條帶，在濃度大于1.25 mmol/L 條件下有相應(yīng)3條條帶，為保證擴(kuò)增效率，選擇最佳Mg2+濃度為1.50 mmol/L。三重PCR 最佳反應(yīng)模式為：預(yù)變性 94℃ 2 min；94℃ 30 s、59.2℃ 30 s、72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。

圖1 三重PCR退火溫度梯度電泳結(jié)果

圖2 引物濃度梯度電泳結(jié)果

圖3 dNTP Mixture濃度梯度電泳結(jié)果

圖4 Mg2+濃度梯度電泳結(jié)果

2.3 三重PCR方法特異性試驗(yàn)

利用所建立的三重PCR方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)，分別對H7N9、H1N1、H9N2、IBV、NDV 進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5，H7N9亞型流感病毒模板可擴(kuò)增出3條特異性條帶，分別為304、160、458 bp，與預(yù)期相符，H1N1和H9N2亞型流感病毒模板則只擴(kuò)增出458 bp的流感病毒通用條帶，而IBV、NDV均無任何擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，表明該方法具有良好的特異性。

圖5 特異性試驗(yàn)電泳結(jié)果

2.4 三重PCR方法敏感性試驗(yàn)

將pMD-NA、pMD-HA及pMD-M重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別為6 ng～0.006 pg，利用所建立的三重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖6，重組質(zhì)粒稀釋至0.6 pg時(shí)，可擴(kuò)增出3條特異性條帶，而稀釋至0.06 pg以下時(shí)，則幾乎無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，表明所建立的三重PCR方法最低能檢出0.6 pg的模板，說明該方法具有良好的敏感性。

圖6 敏感性試驗(yàn)電泳結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

使用建立的三重PCR方法對市場采集的470份咽肛拭子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，沒有檢測出H7N9陽性樣品，但是其中有4份樣品擴(kuò)增出458 bp的AIV通用條帶，表明這4份樣品感染了其他亞型的流感病毒。采用世紀(jì)元亨公司的禽流感病毒H7亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行檢測，也未檢出陽性，證實(shí)所建立的三重PCR檢測方法的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與討論

H7N9 亞型流感病毒是一種新型的流感病毒，能引起人感染死亡，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成重大威脅［3］。研究表明，H7N9 亞型流感病毒 HA發(fā)生了G186V 及 Q226L 關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變異，從而使得新型 H7N9 禽流感病毒更易與人上呼吸道SAα-2、6-Gal 受體結(jié)合，使其感染人的能力增強(qiáng)［12］。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)H7N9 病毒已經(jīng)發(fā)生基因突變，由原來對家禽無致病力病毒株變?yōu)楦咧虏⌒圆《径局辍Ｒ虼?，加?qiáng)源頭控制，及時(shí)發(fā)現(xiàn)H7N9 亞型流感病毒則顯得尤為重要。而分子生物學(xué)技術(shù)因其具有快速、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于 H7N9 流感病毒核酸檢測，是目前眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。其中實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測方法已大規(guī)模用于流感監(jiān)測，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測方法也是用于RNA病毒基因檢測最普遍的方法，也較為廣泛用于H7N9 流感病毒的核酸檢測［13-14］。多重 RT-PCR法因其具有多個(gè)特異性引物，在一個(gè)反應(yīng)中可同時(shí)檢測多個(gè)病毒亞型，是一種經(jīng)濟(jì)有效的檢測方法，因而得到廣泛應(yīng)用［15-19］。

本研究針對 H7 亞型流感病毒的 HA 基因、N9 亞型流感病毒的 NA 基因和所有亞型流感病毒 M 基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)了多對特異性引物，并通過實(shí)驗(yàn)，將3對最佳特異性引物組合在一起，并分別對退火溫度、引物濃度、dNTP Mixture濃度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了H7N9亞型流感病毒三重PCR檢測方法。該方法檢測可確定H7N9亞型流感病毒，也可鑒別H7亞型流感病毒、N9亞型流感病毒或其他亞型流感病毒。

本研究所建立的三重PCR方法，對于H7N9模板可擴(kuò)增出3條特異性條帶，即304、160、458 bp，H1N1和H9N2模板可擴(kuò)展出458bp的 AIV 通用條帶，而 IBV、NDV 均無任何擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，表明該方法具有良好的特異性。通過敏感性試驗(yàn)，本方法最低能檢出 0.6 pg 的模板，證明該方法的敏感性較高。本研究建立的三重PCR方法，為快速鑒別和監(jiān)測 H7N9 亞型流感病毒提供了技術(shù)手段，特別是對于尚不具備熒光定量 RT-PCR 檢測條件的實(shí)驗(yàn)室，該方法是一種鑒別 H7N9 病毒的重要檢測方法。

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