譚 琳，周兆禧，王甲水，馬伏寧，康由發(fā)

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站/海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570102；2.海南大學(xué)城西校區(qū)管委會(huì)，海南 海口 571101）

乙酰膽堿是參與學(xué)習(xí)記憶等生理活動(dòng)的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)。乙酰膽堿酯酶抑制劑能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，提高腦內(nèi)乙酰膽堿的水平，從而延緩阿爾次海默癥病情的發(fā)展［1］。α-葡萄糖苷酶抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸內(nèi)各種α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖水平的升高，可用于糖尿病的治療［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些水果多酚在具有抗氧化性的同時(shí)，還能夠抑制乙酰膽堿酯酶或α-葡萄糖苷酶的活性［3］，這為人們通過(guò)膳食預(yù)防或治療阿爾次海默癥和糖尿病等慢性疾病提供了理論依據(jù)。因此，對(duì)水果中的功能因子進(jìn)行相關(guān)活性評(píng)價(jià)，已經(jīng)成為果品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

山竹（Garcinia mangostana）也稱鳳果、倒稔子或莽吉柿，是一種藤黃科藤黃屬熱帶水果，廣泛分布于馬來(lái)西亞、泰國(guó)、印度尼西亞和菲律賓等東南亞國(guó)家［4-5］，目前在我國(guó)臺(tái)灣、廣東、廣西、云南和海南等地也有種植。山竹果重55～75 g，果肉白色透明，果實(shí)可食部分占29%～45%，不僅味道鮮美，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪 、維生素B以及豐富的礦物質(zhì)和微量元素［6］。山竹果皮作為傳統(tǒng)醫(yī)藥，被廣泛用于治療腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、化膿、慢性潰瘍等疾?。?］。近年來(lái)，人們對(duì)山竹果皮中的多酚及其化學(xué)成分開(kāi)展了大量的抗氧化［8］、防癌［9］、抑菌［10］和抗癌活性評(píng)價(jià)［11］，但是對(duì)山竹果肉多酚的抗氧化活性、乙酰膽堿抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的報(bào)道極少，且產(chǎn)地不同的山竹其果皮多酚的含量及生物學(xué)活性可能存在差異。為此，本研究對(duì)海南山竹果肉和果皮的多酚含量、多酚的抗氧化活性以及乙酰膽堿酯酶和α-糖苷酶的抑制活性進(jìn)行了測(cè)定，為引導(dǎo)山竹消費(fèi)提供理論依據(jù)，為山竹的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試山竹果實(shí)于2014年10月30日采自海南省五指山毛道鄉(xiāng)山竹果園。

主要試劑：沒(méi)食子酸（gallic acid，GA），為阿拉丁試劑上海有限公司產(chǎn)品；乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase）、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide，ATCI）、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

儀器與設(shè)備：UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）、Thermo Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山竹果皮和果肉多酚的提取 將山竹果皮和果肉分離，40℃烘干后粉碎，過(guò)孔徑245 μm篩。稱取2.5 g樣品，加入95%乙醇100 mL，微波輔助提?。?00 MHz，40℃）3 h，過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得到山竹果皮和果肉浸膏（多酚提取物）。

1.2.2 總酚含量的測(cè)定 采用Singleton等［12］的福林-酚比色法。將山竹果皮和果肉浸膏用無(wú)水乙醇配制成濃度為1 mg/mL的樣品，取0.2 mL樣品和 0.5 mL雙蒸水、125 μL的Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)6 min后，加入4 mL 2%（W/V）碳酸鈉溶液及1 mL雙蒸水，暗處反應(yīng)90 min后，760 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度?？偡雍坑脹](méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，最終的山竹果皮和果肉總酚含量用每克干粉所含有的沒(méi)食子酸當(dāng)量表示（mg GAE/g）。

1.2.3 羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定 參照陳健等［13］的方法，將山竹果皮和果肉浸膏用雙蒸水配制成濃度為0.25～4 mg/mL的樣品。在試管中依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、1 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、1 mL雙蒸水、1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，充分混勻后，加入1 mL 0.01% 過(guò)氧化氫，37℃水浴1 h，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A損，損傷管），以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。IC50值為自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度，·OH清除率計(jì)算公式如下：

式中，A空為用雙蒸水代替A損反應(yīng)中的過(guò)氧化氫時(shí)的吸光度；A樣為用樣品代替A損反應(yīng)中的雙蒸水時(shí)的吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［14］的方法，將山竹果皮和果肉浸膏用無(wú)水乙醇配制成0.25～4 mg/mL的樣品，取0.2 mL樣品溶液和2 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇在室溫反應(yīng)30 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。DPPH清除率計(jì)算公式如下：

式中，Ai為樣品吸光度，Ac為對(duì)照吸光度，Aj為樣品本底吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 采用鄭曉燕等［15］的方法，將山竹果皮和果肉多酚浸膏用雙蒸水配制成濃度為0.25～6 mg/mL的溶液，取0.2 mL各濃度樣品和1.9 mL ABTS+·工作液反應(yīng)6 min，于 734 nm波長(zhǎng)處量取吸光度（Ai），以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算ABTS+·清除率：

式中，Aj為以雙蒸水取代ABTS+·工作液反應(yīng)體系的吸光度，A0為以雙蒸水取代樣品溶液反應(yīng)體系的吸光度。

1.2.6 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測(cè)定 采用文獻(xiàn)［16-17］的方法，并稍作改動(dòng)。將山竹果皮和果肉浸膏用PBS配制成62.5～1 000 μg/mL的樣品，在96 孔板中依次加入50 μL PBS、25 μL樣品、25 μL乙酰膽堿酯酶（1.0 μg/mL），4℃放置20 min，然后加入25 μL ATCI （0.30 mg/mL）、125 μL DTNB（0.59 mg/mL），37℃孵育20 min，以石杉?jí)A甲為陽(yáng)性對(duì)照，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算乙酰膽堿酯酶活性抑制率：1.2.7 α-糖苷酶抑制活性的測(cè)定 參照朗國(guó)竣［18］的方法，將山竹果皮和果肉浸膏用PBS配制成1～5 mg/mL的樣品，在96 孔板中依次加入 90 μL PBS緩沖液、20 μL 0.57 U/mL α-葡萄糖苷酶、10 μL 3 mmol/L谷胱甘肽溶液、20 μL樣品，37℃反應(yīng)15 min后，加入10 mmol/L PNPG 40 μL，37℃反應(yīng)15 min，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同時(shí)設(shè)定相同條件下樣品空白對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照以及以阿卡波糖為抑制劑的陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算α-糖苷酶活性抑制率，并求出相應(yīng)IC 值：

采用Excel 2007繪制曲線，利用Excel中的FORECAST命令，通過(guò)線性回歸方程，返回一個(gè)預(yù)測(cè)值，計(jì)算IC50値，使用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山竹果皮、果肉總酚含量

采用福林-酚比色法測(cè)定了山竹果皮、果肉的總酚含量，沒(méi)食子酸對(duì)照品在20～100 μg的范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0008X + 0.0559（R2= 0.997），測(cè)定獲得的山竹果皮中的多酚含量為21.36 mg/g（干重），山竹果肉多酚為0.388 mg/g（干重）。

2.2 山竹果皮、果肉多酚的·OH清除能力

從圖1可以看出，當(dāng)山竹果皮多酚濃度為50 μg/mL時(shí)，清除率已達(dá)51.8（±1.41）%。隨著濃度的增加，清除活性也逐漸上升。當(dāng)濃度為200 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)95.66（±1.74）%，與對(duì)照Vc相比，其清除能力更強(qiáng)（P＜0.05）。山竹果皮多酚清除·OH的IC50值為37.39（±3.63） μg/mL。山竹果肉多酚在濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除能力很弱，僅為5.72（±0.14）%，但是其清除能力表現(xiàn)出隨濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)。在山竹果肉多酚濃度為800 μg/mL時(shí)，其清除活性達(dá)50.37（±1.13）%。

圖1 山竹果皮、果肉多酚的·OH清除活性

2.3 山竹果皮、果肉多酚的DPPH自由基清除能力

由圖2可知，當(dāng)山竹果皮多酚濃度為25 μg/mL時(shí)，其清除 DPPH的活性為27.82（±1.28）%，隨著濃度的增大，山竹果皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除活性明顯增強(qiáng)，當(dāng)山竹果皮多酚濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到86.75（±1.72）%。之后隨著濃度增加，清除能力逐漸達(dá)到飽和。山竹果皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力與Vc的清除能力沒(méi)有顯著差異。其清除DPPH自由基的IC50值為46.34（±1.35） μg/mL。相對(duì)而言，山竹果肉多酚清除 DPPH自由基的能力較弱，當(dāng)其濃度為400 μg/mL時(shí)，清除活性僅為20.37（±0.83）%，與Vc相比有極顯著差異。

圖2 山竹果皮、果肉多酚的DPPH自由基清除活性

2.4 山竹果皮、果肉多酚的ABTS+·清除能力

從圖3可以看出，當(dāng)山竹果皮多酚濃度為25 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除能力為30.52（±1.28）%。隨著濃度的增加，其ABTS+·清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，山竹果皮多酚對(duì)ABTS+·的清除率達(dá)90.52（±1.2）%，與Vc的ABTS+·清除能力相當(dāng)。山竹果皮多酚清除ABTS+·的IC50為41.37（±0.98）μg/mL。山竹果肉多酚濃度為25 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·清除活性為12.02（±0.81）%。隨著濃度的增加，清除活性也隨之增加。當(dāng)濃度為600 μg/mL時(shí)，其清除活性達(dá)65.41（±1.21）%。與山竹果皮多酚和Vc相比有顯著差異，其IC50為361.96（±17.58） μg/mL。

圖3 山竹果皮、果肉多酚的ABTS+· 清除活性

2.5 山竹果皮、果肉多酚的乙酰膽堿酯酶抑制活性

從圖4可以看出，當(dāng)山竹果皮多酚濃度為25 μg/mL時(shí)，對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制率達(dá)到51.5（±1.14）%。當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)87.18（±2.4）%，其 IC50為29.46（±0.25） μg/mL。山竹果肉多酚對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性較弱，濃度為100 μg/mL時(shí)抑制率僅為20.87（±0.89）%。在一定濃度范圍內(nèi)，抑制率呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，但活性低，與陽(yáng)性對(duì)照石杉?jí)A甲相比有極顯著差異。

圖4 山竹果皮、果肉多酚的乙酰膽堿酯酶抑制活性

2.6 山竹果皮、果肉多酚的α-葡萄糖苷酶抑制活性

從圖5可以看出，當(dāng)山竹果皮多酚濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性達(dá)89.74（±2.2）%，表現(xiàn)出比陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖更強(qiáng)的抑制活性（P＜0.05）。隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制活性略有增強(qiáng)并趨于飽和，其IC50為7 μg/mL。山竹果肉多酚在濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性為32.17（±0.83）%。隨著濃度增加，抑制活性也上升。當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí)，抑制活性達(dá)52.2（±1.39）%，其IC50為 2.24（±0.06） mg/mL。

圖5 山竹果皮、果肉多酚的α-葡萄糖苷酶酶抑制活性

3 討論

本研究以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇提取了產(chǎn)自海南山竹的果皮和果實(shí)多酚，F(xiàn)olin-酚法測(cè)定其總酚含量分別為21.36、0.388 mg/g（干重）。山竹果皮多酚對(duì)·OH、DPPH自由基和ABTS+·均具有良好的清除活性，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，IC50值分別為37.39（±3.63）、41.34（±1.55）、41.37（±0.98） μg/mL。陶鈺等［19］從廣西市售的山竹果皮提取的多酚對(duì)·OH 、DPPH自由基清除能力的IC50值分別為55.1（±0.7）、32.5（±0.5） μg/mL。張曉南等［20］從哈爾濱市售山竹果皮中提取的多酚物質(zhì)清除DPPH·自由基IC50值為15.69 μg/mL，表明海南山竹果皮多酚的抗氧化活性與其他地區(qū)的相比差異不大。

海南山竹果皮多酚還具有顯著的α-糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性，這可能與果皮中含有的氧雜蒽酮有關(guān)。研究顯示，氧雜恩酮是山竹中的主要活性成分，在植物營(yíng)養(yǎng)素家族中有著強(qiáng)大的抗氧化能力，而α-倒捻子素是其中一種最重要的天然氧雜蒽酮衍生物之一，具有良好的α-糖苷酶活性抑制［21］。Khaw等［22］研究發(fā)現(xiàn)，山竹果皮中的異戊烯基氧雜蒽酮類化合物具有乙酰膽堿酯酶抑制活性。

山竹果肉多酚對(duì)·OH、DPPH自由基和ABTS+·的清除活性顯著低于山竹果皮多酚，其酚含量也遠(yuǎn)低于山竹果皮酚含量，這表明山竹的酚含量與其抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性有密切關(guān)系。

綜上，本試驗(yàn)體外研究表明，海南山竹果皮多酚具有強(qiáng)抗氧化性、乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性；山竹果肉多酚也具有一定的抗氧化性和乙酰膽堿酯酶抑制活性以及中等程度的α-糖苷酶抑制活性，但它們?cè)隗w內(nèi)是否能夠發(fā)揮同樣的效應(yīng)尚不得而知。因此，有必要進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證山竹果皮、果肉多酚的抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性。

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