施蔚，杜容

血小板是血液的一種重要的組成部分，具有改善血液系統(tǒng)疾病及相關(guān)疾病患者出血癥狀，及降低出血致死率的重要功效[1-2]。然而血小板輸注治療也并非是無(wú)任何局限性的，其臨床療效也無(wú)法滿足患者的全部意愿。血小板輸注無(wú)效（PTR）是臨床輸血治療當(dāng)中經(jīng)常遇到的一項(xiàng)嚴(yán)重問題，也是血小板維持治療患者的一項(xiàng)最為嚴(yán)重難題，臨床上PTR的發(fā)生率較高，因此受到臨床廣泛關(guān)注。由血小板同種人類白細(xì)胞抗原（HLA）抗體導(dǎo)致的免疫性PTR為PTR的一種最常見類型。免疫性 PTR的最佳解決方法為根據(jù)患者的HLA抗體檢測(cè)結(jié)果輸注與患者HLA能夠相容的血小板，因此HLA抗體的檢測(cè)方法對(duì)于血小板臨床輸注治療具有關(guān)鍵性作用[3-4]。本研究比較傳統(tǒng)補(bǔ)體依賴微量淋巴細(xì)胞毒交叉法與流式細(xì)胞血小板交叉法對(duì)檢測(cè) HLA抗體的價(jià)值，并對(duì)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果配型后的血小板輸注治療效果與患者臨床癥狀及血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性與差異性進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省諸暨市人民醫(yī)院2014年1月至2017年1月收治的不同疾病血小板輸注超過2次的患者78例，排除非免疫性PTR患者。其中男42例，女36例；年齡18～61歲，平均（41.26±10.06）歲。

1.2 檢測(cè)方法 全部患者分別采取流式細(xì)胞血小板交叉法（Flow-XM）及補(bǔ)體依賴微量淋巴細(xì)胞毒交叉法（NIHCDC）檢測(cè)HLA抗體。使用恒信化學(xué)試劑公司出品的淋巴細(xì)胞分離試劑；美國(guó)Becton Dickinson出品的PE抗人CD3單體克隆抗體、FITC抗人IgG單體克隆抗體。檢測(cè)設(shè)備為美國(guó)BD公司出品的FACSCanto-Ⅱ型流式細(xì)胞儀，上海精誼儀器設(shè)備公司出品的XSY-1倒置熒光顯微鏡。以Ficoll-Hypaque離心梯度法分離出供應(yīng)血源的淋巴細(xì)胞，按1×PBS對(duì)淋巴細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行調(diào)整后開展后續(xù)檢測(cè)。分離后的淋巴細(xì)胞分別行 NIHCDC、Flow-XM檢測(cè)。以同期在本院接受健康體檢的AB型血健康者混合血清設(shè)制為陰性對(duì)照血清。

NIH-CDC檢測(cè)，將淋巴細(xì)胞的懸合液與對(duì)照血清及補(bǔ)體于37℃下共同孵育60min，使用熒光液終止并固定反應(yīng)，使用熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果。

Flow-XM檢測(cè)，將分離出的淋巴細(xì)胞懸合液與預(yù)處理的血清充分混勻，于室溫條件下孵育15 min，選取適當(dāng)?shù)味葻晒饪贵wFITC-抗IgG、PE-抗CD3標(biāo)記染色、孵育后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。比例為1×105～1.25×105細(xì)胞，預(yù)處理的受者血清劑量為25 l，讀取10000個(gè)淋巴細(xì)胞。兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性結(jié)果均以陰性對(duì)照血清的均值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo) 比較NIH-CDC、Flow-XM檢測(cè)HLA的陽(yáng)性率；將患者最后一次以隨機(jī)輸注ABO同型血小板后的臨床效果與NIH-CDC、Flow-XM配型后（取最高陽(yáng)性結(jié)果）輸注的效果進(jìn)比較；同時(shí)觀察患者治療前后血小板計(jì)數(shù)及臨床出血癥狀的變化情況；分析不同配型輸注血小板的效果與血小板計(jì)數(shù)及出血癥狀的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采取 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采取Spearman等級(jí)相關(guān)性分析＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Flow-XM配型輸注前后血小板計(jì)數(shù)及出血癥狀發(fā)生率比較

2 結(jié)果

2.1 HLA抗體陽(yáng)性率 Flow-XM檢測(cè)HLA抗體的陽(yáng)性 73例，準(zhǔn)確率為93.59%；NIH-CDC檢測(cè)陽(yáng)性65例，準(zhǔn)確率為 83.33%。兩者準(zhǔn)確率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=4.019＜ 0.05）。

2.2 臨床效果 Flow-XM 配型后臨床有效72例，有效率為92.31%；隨機(jī)輸注臨床有效2例，有效率為2.56%。Flow-XM配型臨床有效率高于隨機(jī)輸注臨床有效率（2=125.972＜ 0.05）。

2.3 血小板計(jì)數(shù)及臨床癥狀觀察 輸注后血小板計(jì)數(shù)顯著升高，出血癥狀發(fā)生率顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見表1。

2.4 相關(guān)性分析 Flow-XM 配型輸注的臨床有效率與出血癥狀發(fā)生率呈中度正相關(guān)（=0.577＜0.05），與血小板計(jì)數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)（=－0.896＜0.05）。

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，汽車保有量極大增長(zhǎng)，建筑生產(chǎn)類項(xiàng)目大量開展，交通傷、墜落傷等外傷發(fā)生率的不斷升高，同時(shí)隨著氣候、環(huán)境、生活習(xí)慣等的重大改變，我國(guó)出血性疾病的發(fā)生率也逐年上升，這就對(duì)臨床輸血治療提出了更高、更全面的要求。PTR的發(fā)生可對(duì)患者的臨床救治、身體健康與生命安全均構(gòu)成嚴(yán)重威脅。導(dǎo)致 PTR發(fā)生的主要因素有免疫性因素與非免疫性因素[5-8]。非免疫性因素包括血小板質(zhì)量、彌散型血管內(nèi)凝血、骨髓移植、發(fā)熱感染、循環(huán)型免疫復(fù)合物、脾腫大、自身抗體以及藥物相關(guān)抗體等。免疫因素包括，HLA抗體、血小板特異性（HPA）抗體、紅細(xì)胞的相關(guān)抗體[9-10]。免疫因素中以HLA抗體最為常見臨床發(fā)生率約為80%，其次為HPA抗體臨床發(fā)生率為5%～10%。血小板的細(xì)胞膜上存在有HLAA與HLA-B兩個(gè)位點(diǎn)抗原，另外血小板的特異性糖蛋白的陽(yáng)性表達(dá)于 PTR的發(fā)生也具有不容忽視的作用，其中以抗GPIIb/IIIa的自身型抗體為主。

近些年來(lái)，流式細(xì)胞儀的技術(shù)水平與其分析軟件均不斷完善，單體克隆抗體被廣泛研發(fā)，改進(jìn)Flow-XM的檢測(cè)方法，研發(fā)既能夠定性也能夠定量，既能夠?qū)崿F(xiàn)基因分型也能夠?qū)崿F(xiàn)抗體分析的一項(xiàng)流式細(xì)胞檢測(cè)方法對(duì)于 PTR的防治具有重要價(jià)值。血小板資源是臨床上一種十分寶貴的醫(yī)療資源，F(xiàn)low-XM檢測(cè)一方面能夠提高PTR的治療效果，另一方面能夠有效地節(jié)約血小板資源，對(duì)于血液、血小板輸注治療均具有不可或缺的價(jià)值。

本研究表明，F(xiàn)low-XM法檢測(cè)的準(zhǔn)確率優(yōu)于傳統(tǒng)的NIH-CDC檢測(cè)法（＜0.05）。在 Flow-XM 與 NIH-CDC檢測(cè)結(jié)果均呈陰性的樣本當(dāng)中未檢測(cè)出存在針對(duì)供應(yīng)血源的HLA抗體。Flow-XM與NIH-CDC檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性的標(biāo)本，通過對(duì)供、受雙方HLA分型驗(yàn)證，均存在有針對(duì)供方的HLA抗體。Flow-XM陽(yáng)性但 NIH-CDC呈陰性的血樣，在PRA陽(yáng)性患者的樣本中檢測(cè)存在有針對(duì)供方HLA抗原的明確特異性抗體。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)low-XM配型輸注的臨床有效率與出血癥狀發(fā)生率呈中度正相關(guān)（=0.577＜0.05），與血小板計(jì)數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)（=－0.896＜0.05）。

綜上所述，HLA配型在免疫性PTR中的應(yīng)用具有重要價(jià)值，能夠有效提高輸注療效，改善出血癥狀。

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