華琳，賀云蕾，俞露，郭雯玉，許德義，鄧剛

ABO血型系統(tǒng)中，除了A、B、O、AB 4種常見表型外，在人群中還存在一些少見的ABO亞型。實(shí)際工作中時(shí)常會(huì)遇到正反定型不相符的現(xiàn)象，其中較大一部分則是由于亞型的原因引起，正確鑒定紅細(xì)胞血型是確保臨床安全用血的關(guān)鍵[1]。本文對(duì)1例B303亞型患者的臨床輸血情況進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 1例女性患者因外傷做手術(shù)，術(shù)前配血時(shí)發(fā)現(xiàn)ABO血型正反定型不符合，故醫(yī)院將患者血液標(biāo)本送到本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 血型血清學(xué)檢測(cè) 血清學(xué)正反定型及吸收放散試驗(yàn)均按常規(guī)方法操作。主要試劑有：?jiǎn)慰寺】?A、抗-B及反定型紅細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司），人源抗-A、抗-B抗體（自制），抗-AB、抗-H抗體（荷蘭sanquin公司）。

1.3 序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）進(jìn)行ABO血型基因分型采用RelaxGene Blood DNA System（北京TIANGEN公司）提取樣本DNA，具體操作按試劑說明進(jìn)行。采用ABO血型基因分型試劑盒Ready Gene ABO（德國(guó)inno-train公司）進(jìn)行PCR-SSP分型。

1.4 ABO基因測(cè)序分析 按照參考文獻(xiàn)[2-3]中的引物及擴(kuò)增體系，對(duì)ABO基因7個(gè)外顯子及其鄰近內(nèi)含子區(qū)分別擴(kuò)增后送測(cè)序公司（上海桑尼測(cè)序有限公司）測(cè)序。Taq酶購(gòu)自上海Promega公司，PCR儀為Veriti96Well Thermal Cycler（美國(guó)，AB公司），反應(yīng)總體積50 l。1.5 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序 將3、6、7外顯子的PCR產(chǎn)物純化并克隆入pMD8-T載體（TaKaRa公司）后，送公司測(cè)序（上海桑尼測(cè)序有限公司）。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢查結(jié)果 根據(jù)血清學(xué)結(jié)果，初步判斷患者為B亞型。見表1。

2.2 PCR-SSP檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)試劑盒說明書，內(nèi)參產(chǎn)物片段大小為434 bp，各泳道的特異性陽性條帶DNA分子量大小分別為 1（134 bp）、2（133 bp）、3（194 bp）、4（193 bp）、5（195 bp）、6（194 bp）、7（170 bp）、8（170 bp）。先證者電泳圖中第3和7泳道未出現(xiàn)陽性條帶，對(duì)照試劑盒說明書可判定基因型為O/B型（封三彩圖 7）。

2.3 ABO基因測(cè)序分析 患者ABO基因的第1～5外顯子未發(fā)現(xiàn)任何突變，但第6外顯子的261位為G缺失，297位A＞G純合突變。第7外顯子上存在：526G/C、657T/C、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、646T/A、681G/A、771T/C、829A/G雜合。分析鄰近外顯子的內(nèi)含子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)第 3內(nèi)含子存在IVS+5G＞A雜合突變（封三彩圖8）。2.4 單體型序列分析 對(duì)患者標(biāo)本進(jìn)行TA克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，一條單體型為常見的O20，而另一條單體型與B101相比，存在IVS3+5G＞A雜合突變，此突變可引起異常剪切，影響D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（GTB）正常表達(dá)。經(jīng)檢索血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)BGMUT，患者基因型為B303/O20。見封三彩圖8。

3 討論

ABO血型系統(tǒng)具有重要的臨床意義，可引起溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病。ABO基因的直接編碼產(chǎn)物是2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（GTA）和GTB。通過這2個(gè)酶的催化作用，在紅細(xì)胞膜的H前體糖鏈上分別添加2個(gè)不同的單糖基團(tuán)，并分別形成A或B抗原，可見轉(zhuǎn)移酶是抗原形成的關(guān)鍵[4]。B3亞型是ABO血型一種較為常見的弱表現(xiàn)型，其血清學(xué)最主要特點(diǎn)是B3細(xì)胞與相應(yīng)抗體出現(xiàn)混合視野外觀。已證實(shí) ABO血型系統(tǒng)不同的亞型是由于基因水平上核苷酸變化所引起的，其突變范圍涉及7個(gè)外顯子和部分內(nèi)含子區(qū)域，包括缺失、插入和點(diǎn)突變[5-6]。

表1 先證者及家系血清學(xué)檢查結(jié)果

本例患者血清學(xué)特點(diǎn)是正定抗-B出現(xiàn)混合凝集，反定存在冷反應(yīng)性抗-B抗體，符合B3亞型的特征。測(cè)序結(jié)果表明，與B101序列相比，患者有一條等位基因第1～7外顯子與正常GTB基因一致，僅在第3內(nèi)含子發(fā)生IVS3+5G＞A雜合突變，此突變可影響剪接供體，使其發(fā)生異常剪切，RNA加工時(shí)第3外顯子被直接跳過，導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄本中沒有第3外顯子，翻譯產(chǎn)物中缺乏19個(gè)氨基酸，影響GTB正常表達(dá)，可能導(dǎo)致GTB酶的活性或特異性改變，導(dǎo)致B抗原數(shù)量或特異性的改變，屬于比較少見的B303亞型。Yu等[7]最早對(duì)B303亞型進(jìn)行了報(bào)道。目前發(fā)現(xiàn)的B3等位基因己有 16種[8]，其中12例（B301、B302、B304、B305、B306、B307、B308、B309、B310、B313、B315、B316）為外顯子上的點(diǎn)突變導(dǎo)致不同的氨基酸改變，1例（B314）為第1外顯子上堿基缺失導(dǎo)致移碼突變，2例（B311、B312）為起始密碼子上游調(diào)控區(qū)域堿基缺失或突變。而B303等位基因則與上述3個(gè)B3等位基因有發(fā)生機(jī)制所不同，是由于內(nèi)含子突變導(dǎo)致的剪切異常而形成。

ABO亞型的血液，由于抗原與抗體共存，在臨床使用過程中往往表現(xiàn)為血型定型和配血困難。由于各種原因，B亞型往往被誤定為O型，誤定為O型的B亞型患者，若輸注了O型血液；或誤定為O型的B亞型獻(xiàn)血者的血液，輸注給O型患者，常常會(huì)出現(xiàn)輸血反應(yīng)。本例患者由于是B亞型，臨床輸血時(shí)使用洗滌O型紅細(xì)胞及AB型血漿，輸注O型洗滌紅細(xì)胞雖然相對(duì)安全，但畢竟為異型血，仍要控制輸血速度，并控制單次輸血量和輸血間隔時(shí)間，同時(shí)也要嚴(yán)格做好圍術(shù)期的血液管理，減少自體血液的丟失和異體血的輸入。綜合上述措施，本例患者取得了不錯(cuò)輸血效果。

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