鄒自英，劉 霞，劉 媛

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染性疾病中最常見的非發(fā)酵型細菌之一，碳青酶烯類耐藥的銅綠假單胞菌具有多種耐藥機制[1-6]，其中產生金屬酶和形成被膜結構是其主要的兩種耐藥機制。為探討醫(yī)院銅綠假單胞菌臨床菌株的耐藥機制，本研究對醫(yī)院臨床分離的89株銅綠假單胞菌進行金屬酶基因檢測和生物被膜形成能力研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源 89株銅綠假單胞菌均為2016年5～11月從醫(yī)院臨床送檢標本中分離得到，其中來自痰液41株，傷口12株，血液9株，尿液7株，膿液6株，胸水5株，膽汁3株，腹水2株，玻璃體液1株，關節(jié)液1株，引流液1株，支氣管灌洗液1株。標準菌株ATCC27853購自中國工業(yè)菌種保藏所，采用貝索公司的菌種凍存管-80℃留存。

1.1.2 儀器及試劑 法國梅里埃公司的VITEK2 COMPACT儀器、GN鑒定卡、AST-GN13藥敏卡，美國伯樂公司的PCR儀，上海天呈公司的TOCAN凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物敏感性試驗 采用AST-GN13卡檢測各抗菌藥物的敏感性，結果評價按2017年CLSIM100-S27 判斷[7]。

1.2.2 基因檢測 采用PCR方法檢測各種金屬酶基因，基因引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，序列見表1。基因提取方法及PCR反應條件參照文獻[1]。

1.2.3 細菌生物膜半定量檢測 采用半定量結晶紫染色法，參照文獻[5-6]的方法。對數(shù)期菌液用M-H培養(yǎng)液調節(jié)濃度為1×109CFU/ml，200μl/孔接種96孔板，每株菌設3復孔，37℃培養(yǎng)32 h。200μl/孔PBS 清洗 4 次，50 μl/孔 Bouin’S 固定液固定 1 h；200μl/孔 PBS再清洗 4次，50μl/孔結晶紫染色2min；自來水輕柔沖洗，自然晾干，200μl/孔95%乙醇脫色，檢測OD550。生物膜產生量評價標準：M-H培養(yǎng)液孔的平均OD550加標準差定義為ODc，待測菌株的OD與ODc比較，將生物膜產生量分為4個等級：陰性（-）：OD＜0Dc；少量（+）：0Dc＜OD≤20Dc；中量（++）：20Dc＜OD≤40Dc；大量：OD＞40Dc。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用WHONET5.6軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 抗菌藥物敏感性試驗結果 銅綠假單胞菌對各種抗菌藥物的敏感性見表2，其中對碳青酶烯類抗菌藥物亞胺培南的敏感率為73.03%，耐藥率和中介率分別為17.98%和8.99%。

2.2 金屬酶基因檢測結果 89株銅綠假單胞菌均未檢出 NDM-1、IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、DIM、TMB、KHM、AIM金屬酶基因。

2.3 產生物被膜菌株分布 92.13%的銅綠假單胞產生物被膜，大部分菌株產生中量或大量生物被膜，見表3。

3 討論

碳青酶烯類耐藥的銅綠假單胞菌治療是目前臨床感染性疾病治療的難點之一，具有治療周期長、不易根除、易反復等特點。既往研究提示，產金屬酶是銅綠假單胞菌對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥的重要因素[8-9]。編碼金屬酶的基因位于質?；蛉旧w上，使得金屬酶基因容易在同種屬及不同種屬細菌間發(fā)生大范圍擴散和傳播，如金屬酶基因中的NDM-1基因，在多種不同種屬的細菌中都能檢測到[8-10]。本組89株銅綠假單胞菌耐藥率和中介率分別為17.98%和8.99%，但均未檢出NDM-1、IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、DIM、TMB、KHM、AIM 金屬酶基因，提示攜帶金屬酶基因不是本組銅綠假單胞菌對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。

表1 靶基因引物序列

表3 銅綠假單胞菌產生物被膜能力[n（%）]

表2 銅綠假單胞菌對抗菌藥物的敏感性構成比（n=89）

被膜銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）顯著升高，文獻報道甚至可以高于浮游菌MIC值的1000倍[5-6]。銅綠假單胞菌被膜菌持久存活于氣道、皮膚、植入體表面等部位，常規(guī)抗感染治療可以消滅浮游菌及表層細菌，卻對深部被膜菌療效欠佳。而被膜結構可釋放其深層細菌，造成感染遷延反復，只有清除掉深部被膜菌，才能徹底治愈感染。本研究89株銅綠假單胞菌中，92.13%具有產生被膜結構能力，與文獻報道近似[6]，說明銅綠假單胞菌臨床菌株普遍產生物被膜能力強，在條件合適的情況下大部分菌株均可在體內形成被膜結構，使得抗感染治療難度增加，這可能是該菌耐藥的主要機制。因此，在治療銅綠假單胞菌感染性疾病過程中，可以選擇敏感抗菌藥物與阿奇霉素等具有穿透生物被膜及抑制被膜菌形成功能的抗菌藥物聯(lián)用，進而取得較好的臨床療效[11-12]。

銅綠假單胞菌的耐藥原因復雜，而本組菌株的主要耐藥原因之一是在體內形成被膜結構。為使得檢測結果更具針對性，應在報告檢測結果時，對臨床提示是否為黏液型菌株生長；在臨床治療有需求時，配合檢測細菌的生物被膜產生能力，便于臨床有針對性地選擇抗菌藥物聯(lián)合使用。

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