李洪玉 陶正升 于瑞峰 吳人杰 壽旦

銀杏葉為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥葉。味甘、苦、澀、平, 歸心、肺經(jīng), 具活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂功效, 臨床用于瘀血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、肺虛咳喘、高脂血癥［1］。主要活性成分為黃酮類、萜類內(nèi)酯和多糖等成分［2-4］。銀杏葉黃酮類成分的含量測定法有紫外分光光度法［5］和高效液相色譜法等。張鑫等［6］采用自制銀杏葉提取物, 測定銀杏制劑中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量, 并與外標(biāo)法測定結(jié)果進行比較, 結(jié)果對照提取物測定法與外標(biāo)法測定結(jié)果均具有精密度高, 穩(wěn)定性、重復(fù)性好等優(yōu)點。楊艷模等［7］以槲皮素為內(nèi)參物, 建立槲皮素與其他6種黃酮類成分相對校正因子, 計算其他6種成分的含量, 以外標(biāo)法測定槲皮素, 利用相對校正因子實現(xiàn)對其他6種黃酮類成分含量測定, 實現(xiàn)一測多評。黃琴偉等［8］以銀杏葉對照提取物和銀杏葉總內(nèi)酯對照提取物為參照, 確立12個共有峰作為銀杏葉制劑的特征峰, 建立了銀杏葉片、膠囊和滴丸的特征圖譜, 為銀杏葉制劑的質(zhì)量控制提供有效方法。銀杏葉黃酮類成分薄層色譜分析常采用硅膠G薄層色譜分析法。賈長英等［9］采用乙酸乙酯預(yù)浸提銀杏葉粉末, 90%乙醇索氏提取, 點于硅膠G薄層層析板上, 展開劑為氯仿∶甲醇∶甲酸∶水(2.5∶2∶1.5∶1.5), 噴以3%三氯化鋁乙醇溶液, 置紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮成分熒光斑點, 對銀杏葉黃酮類成分薄層色譜分析。周繼法等［10］選用甲醇為提取溶劑, 水浴加熱回流提取銀杏葉, 過濾, 濾液作為供試品溶液, 點于硅膠G薄層層析板上, 以正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)上層為展開劑, 對銀菊口服液中的銀杏葉進行定性鑒別。2015版中國藥典銀杏葉黃酮類成分薄層色譜分析方法采用40%乙醇加熱回流提取, 點于用4%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板上, 以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水(5∶3∶1∶1)為展開劑, 噴以3%三氯化鋁乙醇溶液, 置于紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點。聚酰胺薄層色譜也常用于黃酮類成分分析, 并且具有點量少、展程短、分離效率高等優(yōu)點。本文采用聚酰胺薄層色譜法用于銀杏葉黃酮類成分鑒別, 對銀杏葉黃酮類成分的提取條件、展開劑和點樣量等進行比較分析, 具體如下。

1 儀器與試藥

薄層層析展開缸(120 mm×120 mm);TLC Visualizer型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪)；XMTD-204型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；20 cm×20 cm聚酰胺薄膜(臺州市路橋四甲生化塑料廠)。銀杏葉藥材(購自廣東中藥民生堂)；同一棵銀杏樹的樹葉(采自浙江富陽湘溪村)；石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、甲醇、甲酸、三氯化鋁均為分析純；試驗用水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集 樣品1號購自廣東中藥民生堂的銀杏葉藥材, 樣品為綠色干燥葉。樣品2號采自浙江富陽湘溪村銀杏樹葉, 鮮葉經(jīng)過陰干得綠色干燥葉。樣品3號為上述鮮葉在25℃室溫曬干至綠色剛褪去的黃色干燥葉。樣品4號采自上述同一棵銀杏樹的落葉, 為褐色干燥葉。

2.2 銀杏葉黃酮類成分提取方法比較

2.2.1 乙醇超聲提取 取樣品1號銀杏葉藥材粉末約1 g,精密稱定, 加95%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min, 過濾 , 點樣。

2.2.2 70%乙醇超聲提取 取樣品1號粉末約1 g, 精密稱定, 加70%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min,過濾, 點樣。

2.2.3 50%乙醇超聲提取 取樣品1號粉末約1 g, 精密稱定, 加50%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min,過濾, 點樣。

圖1 不同乙醇提取濃度薄層色譜圖

2.2.4 乙酸乙酯脫酯乙醇超聲提取 取樣品1號粉末約1 g,精密稱定, 加乙酸乙酯20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min, 濾去乙酸乙酯, 粉末在60℃條件下烘干, 加95%乙醇20 ml, 超聲提取30 min, 過濾, 取 5ml濾液置蒸發(fā)皿中水浴蒸干, 2 ml乙醇溶解, 點樣。

2.2.5 乙醇超聲提取正丁醇萃取 取樣品1號粉末約1 g,精密稱定, 加95%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min, 過濾, 濾液置60 ml分液漏斗中, 加石油醚20 ml萃取1次, 下層加20 ml水飽和的正丁醇萃取1次, 取5 ml正丁醇萃取液置蒸發(fā)皿中水浴蒸干, 2 ml乙醇溶解, 點樣。

上述五種方法經(jīng)聚酰胺薄層色譜展開, 置于紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點, 結(jié)果顯示2.2.1項下提取方法最好。見圖1, 圖2。

2.3 聚酰胺薄層色譜展開劑條件比較 采用2.2.1項下的提取方法制備供試品溶液, 進行薄層色譜比較, 分別采用展開劑1∶甲醇；展開劑2∶甲醇∶水(7∶3)；展開劑3∶甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)進行比較。展開距離5 cm；顯色劑為3%三氯化鋁乙醇溶液, 比較不同展開劑的分離效果。

置于紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點, 結(jié)果顯示展開劑3∶甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)分離效果最佳, 明顯優(yōu)于展開劑1∶甲醇和展開劑2∶甲醇∶水(7∶3)。因此,選擇甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)為展開劑。見圖3, 圖4,圖5。

2.4 不同點樣量的比較 采用2.2.1項下的提取方法制備供試品溶液, 分別以1、3、5 μl為點樣量, 以2.3項下的展開劑展開, 展開距離5 cm。點樣量3 μl薄層色譜圖黃酮成分熒光斑點分離清晰大小適中。見圖6。

2.5 不同加工方法銀杏葉樣品黃酮類成分薄層色譜 取不同加工方法的銀杏葉樣品, 采用2.2.1項下的提取方法制備供試品溶液, 以2.3項下的展開劑展開, 點樣量3 μl, 展開距離5 cm。不同加工方法銀杏葉樣品薄層色譜黃酮類成分熒光斑點清晰, 分離度和Rf值均較理想。見圖7。

圖2 不同乙醇提取分離條件薄層色譜圖

圖3 甲醇展開劑薄層色譜圖

圖4 甲醇:水展開劑薄層色譜圖

圖5 甲醇∶丙酮∶水展開劑薄層色譜圖

圖6 不同點樣量的薄層色譜圖

圖7 不同加工方法銀杏葉薄層色譜圖

3 討論

銀杏葉粉末黃酮成分中國藥典采用40%乙醇加熱回流提取, 洪美華等［11］比較熱回流提取和超聲提取, 結(jié)果一致,超聲方法簡單穩(wěn)定。本文采用超聲提取方法, 同時對5種不同的黃酮成分提取分離條件通過薄層色譜圖黃酮成分熒光斑點進行比較, 結(jié)果95%乙醇超聲提取法效果最好, 95%乙醇超聲提取薄層色譜圖黃酮成分熒光斑點明顯大于正丁醇萃取法和乙酸乙酯脫酯法, 說明乙酸乙酯脫酯和正丁醇萃取過程中黃酮類成分有損失。

聚酰胺薄層色譜不同展開劑甲醇、甲醇∶水(7∶3)和甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)比較：甲醇為展開劑紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點, 結(jié)果顯示出黃酮類成分2個主要熒光斑點和2個弱熒光斑點；甲醇∶水(7∶3)為展開劑顯示出1個主要熒光斑點和1個弱熒光斑點, 其他黃酮類成分熒光斑點沒有分離開；甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)為展開劑顯示出4個主要熒光斑點和3個弱熒光斑點。展開劑甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)好于甲醇展開劑和甲醇∶水(7∶3)展開劑。甲醇∶水(7∶3)展開劑中加入丙酮展開劑形成甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)展開劑, 展開黃酮類成分的效果好, 可能是丙酮和黃酮類成分的分子結(jié)構(gòu)中都有羰基結(jié)構(gòu)相似相溶, 更易于黃酮類成分的展開。

銀杏葉采集加工中國藥典規(guī)定秋季葉尚綠時采收, 及時干燥, 但沒有規(guī)定具體干燥方法, 羅實等［12］采用直接烘烤、曬干后烘烤、殺青晾置后烘烤、微波和恒溫鼓風(fēng)5種方法干燥銀杏鮮葉, 以銀杏葉總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯含量為評價指標(biāo), 結(jié)果恒溫鼓風(fēng)干燥方法最佳。蔣明廉［13］以黃酮類成分為指標(biāo)采集同一棵樹葉比較了鮮葉、生曬葉、陰干葉、冷藏葉、60℃干燥葉和80℃干燥葉, 結(jié)果以鮮葉和陰干葉為好。本文采集同一棵銀杏樹葉, 用陰干和室溫干燥的加工方法, 對3種不同顏色銀杏樹葉黃酮類成分薄層色譜鑒別分析,3種不同顏色銀杏樹葉均含有黃酮類成分, 若評價其質(zhì)量還需結(jié)合銀杏葉總黃酮含量等指標(biāo)進行綜合評價。

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