(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

不管是高等植物還是低等植物，氮素的同化都是一個(gè)非常重要的生理過程。無機(jī)氮只有被轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，才能被植物細(xì)胞所吸收利用。細(xì)胞內(nèi)氮的吸收同化過程有三個(gè)主要步驟：第一步是氮的跨膜運(yùn)輸，環(huán)境介質(zhì)中的氮被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)；第二步是硝酸鹽在硝酸還原酶(NR)和亞硝酸還原酶(NiR)作用下轉(zhuǎn)化成氨；第三步是氨在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下被轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮。GS作為細(xì)胞內(nèi)氮和碳同化的樞紐，在這一同化過程中起著關(guān)鍵性的作用[1-5]。

海洋赤潮是一個(gè)嚴(yán)重的生態(tài)問題，尤其是有毒赤潮，越來越引起重視。鏈狀亞歷山大藻是全球分布較廣的有毒赤潮藻種，能產(chǎn)生麻痹性貝類毒素(PSP毒素)，毒害人類、鳥類和魚類[6-8]。本研究以鏈狀亞歷山大藻為實(shí)驗(yàn)材料，通過離子交換、分子篩和疏水層析等純化技術(shù)來分離純化GS，并對(duì)GS的理化特性進(jìn)行研究，為從生物化學(xué)角度更深入認(rèn)識(shí)鏈狀亞歷山大藻對(duì)氨的同化機(jī)制及氮營養(yǎng)生理提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鏈狀亞歷山大藻分離自長江口，由廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)中心提供。藻種培養(yǎng)條件是光照周期(光照14 h，黑暗10 h)，光照強(qiáng)度為4 000 Lux，培養(yǎng)溫度為21℃。實(shí)驗(yàn)用海水采自臺(tái)灣海峽外海水。海水經(jīng)過0.45 μm孔徑的濾膜過濾后，高溫滅菌，然后保存在黑暗處。

藻類培養(yǎng)采用半連續(xù)培養(yǎng)的方法。鏈狀亞歷山大藻經(jīng)缺氮f/2培養(yǎng)基馴化后，添加硝酸鹽并在第二天GS活力達(dá)到最高值后，收集藻細(xì)胞用于GS的分離純化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GS活力測(cè)定

在富集得到的藻細(xì)胞中加入1 mL GS抽提液，超聲破碎(功率280 W，2 s)，間隔時(shí)間2 s，破碎次數(shù)40次，破碎后的藻細(xì)胞在70 000×g下離心50 min，每mL上清液中加入100 mmol/L、pH 7.0的鏈霉素硫酸鹽0.1 mL，充分混合均勻后在70 000×g下離心50 min，得到GS粗提液，按照Bernard等的方法測(cè)定GS活力[9]。

1.2.2 GS純化

用孔徑5 μm篩絹過濾收集藻液90 L，離心濃縮至50 mL離心管中(8 000×g，10 min)。加入酶抽提液buffer A(2 mL/g)：50 mmol/L tris-HCl、pH=7.5、2 mmol/L DTE、1 mmol/L EDTA 和2.5 mmol/L MgCl2，冰浴超聲破碎，功率為280 W，間隔時(shí)間/工作時(shí)間=2 s/2 s，破碎5 min。破碎后的粗提液加入一定量的酶抽提液在70 000×g下超高速離心，溫度4℃，時(shí)間50 min。取上清液加入200 μL的鏈霉素(100 μL/mL)混勻，在70 000×g超高速離心，50 min。上清液用0.45 μm孔徑的膜過濾。粗提液通過預(yù)先用buffer A平衡過的DEAE-Seoharose column(2.6 cm×25.0 cm)，采用0.15至1.00 mmol/L 的NaCl梯度洗脫，收集各組分，測(cè)定GS活力。洗脫速度4 mL/min，總洗脫體積400 mL。將DEAE-Seoharose收集到的酶液用超低溫真空濃縮至3 mL，用Sephacry1 S-300分子篩柱(1.6 cm×100.0 cm)進(jìn)一步純化，用含0.15 mol/L的NaCl緩沖液洗脫，收集各組分，測(cè)定GS活力。獲得的酶液用超低溫真空濃縮至3 mL，經(jīng)Phenyl-Sepharose CL-4B層析柱(1.6 cm×20.0 cm)進(jìn)一步純化，收集各組分，測(cè)定GS活力。

1.2.3 GS亞基分子量測(cè)定

根據(jù)Davis[10]的方法，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定亞基分子量。

1.2.4 總分子量測(cè)定

采用Sephacry1 S-300分子篩柱(1.6 cm×100.0 cm)分離的方法確定。

1.2.5 GS特性研究

反應(yīng)最適溫度和最適pH：GS活力反應(yīng)溫度梯度分別為5、10、15、20、25、30和40℃，pH梯度分別為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0和10.0。

金屬離子對(duì)GS活力的影響：選擇Fe3+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、K+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Ce2+和Mg2+金屬例子，反應(yīng)濃度均為0.5 M。

1.2.6 蛋白含量測(cè)定

根據(jù)Bradford[11]的方法測(cè)定收集峰的蛋白含量，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GS純化

GS粗提物經(jīng)離子交換柱梯度洗脫結(jié)果見表1。DEAE-Sepharos柱(2.6 cm×25.0 cm)經(jīng)緩沖液預(yù)平衡后，用0.15～0.50 mol/L NaCl線性梯度洗脫GS粗提物，根據(jù)快速蛋白檢測(cè)結(jié)果分步收集各組峰，并對(duì)收集峰進(jìn)行GS活力測(cè)定，當(dāng)NaCl濃度洗脫至0.32 mol/L時(shí)，GS蛋白被洗脫下來，GS活力為3.55 U·mg-1protein。GS凝膠過濾層析洗脫結(jié)果表明離子交換層析所得GS樣品經(jīng)冷凍干燥后濃縮至3 mL，上樣至Sephacry1 S-300凝膠層析柱中，用0.15 mol/L NaCl抽提緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰進(jìn)行GS活力檢測(cè)，GS活力為15.6 U·mg-1protein。將凝膠過濾層析所得GS樣品，上樣至Phenyl-sepharose CL-4B疏水層析柱中，用含70%乙二醇緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰進(jìn)行酶活檢測(cè)，GS活力為19.86 U·mg-1protein。

2.2 GS分子量及亞基分子量確定

鏈狀亞歷山大藻GS分子量采用凝膠過濾法來確定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白峰洗脫體積分別為：藍(lán)色葡聚糖(Blue dextran)2 000，45.45 mL；甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin)，54.35 mL；鐵蛋白(Ferritin)，60.09 mL；醛縮酶(Aldolase)，66.53 mL；伴白蛋白(Conalbumin)，69.84 mL；卵清蛋白(Ovalbumin)，71.00 mL。GS樣品峰洗脫體積為60.35 mL，通過計(jì)算得出GS分子量為430 kD。

鏈狀亞歷山大藻GS亞基分子量通過變性凝膠電泳來確定，見圖1，通過換算得到亞基分子量大小為55.6 kD。

2.3 GS酶學(xué)特性研究

純GS酶學(xué)特性結(jié)果表明鏈狀亞歷山大藻GS反應(yīng)的適宜pH范圍為7.5到9.5，其中最大酶活力pH為8.0(圖2)。GS活力隨溫度的增加而增加，至25℃時(shí)，GS活力達(dá)到最大，而后隨溫度的進(jìn)一步增加而降低(圖3)。金屬離子對(duì)GS活力影響較大：Fe2+和Fe3+離子參加的反應(yīng)中未檢測(cè)到酶活力，Mg2+離子參加的反應(yīng)中酶活力最高，Cu2+、Ce2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+和K+對(duì)GS活力有不同程度的抑制作用(圖4)。

3 討論

鏈狀亞歷山大藻GS粗提物經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換、Sephacry1 S-300分子篩凝膠過濾和Phenyl-sepharose CL-4B疏水層析等分離純化步驟后，最終得到純化的GS，純化倍數(shù)為130，酶活為19.86 U·mg-1protein，其中在離子交換層析過程中，GS量損失最大，但純化倍數(shù)最高(表1)。GS的催化作用受到環(huán)境因子的影響，反應(yīng)環(huán)境中溫度、pH和離子強(qiáng)度等因素的變化都會(huì)影響酶的活力，特別是經(jīng)過抽提及純化過程處理后，導(dǎo)致酶損失較大，加上鏈狀亞歷山大藻中GS含量極低，致使得率比較低，因此在進(jìn)行GS純化時(shí)，純化速度要快，操作要連續(xù)。

Mann等[12]、Hirel等[13]研究表明，植物細(xì)胞中的GS同功酶因定位不同而產(chǎn)生差異，根據(jù)細(xì)胞中分布，分為GS1和GS2，GS1以細(xì)胞質(zhì)型GS形式存在；GS2以葉綠體型GS形式存在。根據(jù)組成GS單體分子量差別，分為GSⅠ、gGSⅡ和gGSⅢ。Kumadaet等[14]、Amaya[15]等認(rèn)為GSⅠ廣泛分布在細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物中，其亞基分子量大小為55 kD；GSⅡ分布在植物共生菌、真核生物中，其亞基分子量大小為36 kD；GS Ⅲ分布在藍(lán)細(xì)菌中，其亞基分子量為75 kD；相對(duì)于GSⅠ，GSⅡ和GSⅢ分布的種類很有限。Meister[1]和Kleinschmidt[16]研究表明，植物和動(dòng)物組織來源的GS的分子量一般在400 kD左右，有8個(gè)相同的亞基組成，但在不同細(xì)菌類群中，GS分子量大小差別較大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鏈狀亞歷山大藻的GS分子量大小為430 kD，由8個(gè)分子量為55.6 kD亞基組成。根據(jù)亞基分子量大小判斷，鏈狀亞歷山大藻GS屬于GSⅠ類型。

表1 鏈狀亞歷山大藻GS純化

pH是影響酶活力的一個(gè)重要因子。細(xì)胞或生物體內(nèi)的酶常常在某一pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出較大活力，而表現(xiàn)出酶最大活力時(shí)的pH稱為酶的最適pH。pH對(duì)酶反應(yīng)速率的影響，一方面是由于酶本身是蛋白質(zhì)，過酸或過堿易使酶變性失活；另一方面是pH影響了酶分子的活力中心上有關(guān)基團(tuán)的解離或底物的解離，影響酶與底物的結(jié)合，從而影響酶的活力。研究表明，不同生物其GS反應(yīng)的最適pH范圍也不相同。Ahmed等[17]研究多種海洋浮游植物GS反應(yīng)最適pH范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)，GS反應(yīng)的最適pH范圍為7.0到8.0。Bressler等[2]報(bào)道，中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、魯茲帕夫藻(Pavlovalutheri)、偽矮海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)等GS的最適反應(yīng)pH為7.0到7.8。García-Fernández等[18]報(bào)道Monoraphidriumbraunii綠藻的 GS反應(yīng)最適pH范圍為7.5 到8.0。Kim等[19]在研究Klebsiellapneumoniae細(xì)菌GS在 pH為8.0時(shí)酶活力最大。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈狀亞歷山大藻GS反應(yīng)較適pH范圍較廣，為7.5～9.5，其中最大酶活力為pH 8.0。

溫度是影響酶活力的另一個(gè)重要因子。絕大多數(shù)酶在低溫時(shí)酶反應(yīng)進(jìn)行緩慢，當(dāng)溫度逐漸升高時(shí)，反應(yīng)速率也逐漸升高，達(dá)到最高值后，反應(yīng)速率隨溫度的進(jìn)一步升高迅速降低[1]。在一定條件下，一種酶只在某一溫度時(shí)活力最大，該溫度就是酶反應(yīng)的最適溫度。鏈狀亞歷山大藻GS在溫度5～40℃范圍均能反應(yīng)，最適的反應(yīng)溫度為25℃。

GS參加的反應(yīng)需要在一定金屬離子作為底物的條件下才能進(jìn)行，且對(duì)金屬離子具有選擇性。Kim等[19]在研究Klebsiellapneumoniae細(xì)菌GS特性發(fā)現(xiàn)，該菌GS在金屬M(fèi)n2+、Cu2+、Ni2+存在下，GS活力能表達(dá)，而在Fe2+、Fe3+、K+、Pb2+、Zn2+、Ca2+、Ce2+存在下GS活力為0。Kameya[20]等在研究嗜熱鏈球菌(Hydrogenobacterthermophilus)時(shí)也發(fā)現(xiàn)GS在金屬M(fèi)g2+離子存在下活力最高。本研究發(fā)現(xiàn)Cu2+、K+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Ce2+和Mn2+對(duì)GS有不同程度的抑制作用，F(xiàn)e2+和Fe3+則完全抑制了GS的活力，而在Mg2+離子存在下活力最高(圖4)。

4 小結(jié)

1)鏈狀亞歷山大藻GS粗提物經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換、Sephacry1 S-300分子篩凝膠過濾和Phenyl-Sepharose CL-4B疏水層析等處理后，得到純的GS，分子量為430 kD，由8個(gè)分子量為55.6 kD的亞基組成。按照亞基分子量的大小判斷，鏈狀亞歷山大藻GS屬于GSⅠ類型。

2)GS反應(yīng)的最適pH和溫度分別為8.0和25℃。Mg2+離子參與的GS反應(yīng)，GS活力表達(dá)最高，Cu2+、K+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Ce2+、Mn2+對(duì)GS活力均有一定的抑制作用，F(xiàn)e2+和Fe3+則完全抑制了GS活力。

3)本研究從鏈狀亞歷山大藻中分離、純化GS，但所做工作還比較初步，對(duì)GS的認(rèn)識(shí)還有待進(jìn)一步深入研究，如GS的分子調(diào)控機(jī)制和不同營養(yǎng)鹽條件下GS的表達(dá)等，有助于更加深入地認(rèn)識(shí)鏈狀亞歷山大藻的氮營養(yǎng)生理特性和赤潮形成的營養(yǎng)學(xué)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Meister A.Glutamine synthetase of mammals [J].Enzymes，1974，10：699-754.

[2]Bressler S L，Ahmed S I.Detection of glutamine synthetase activity in marine phytoplankton：Optimization of the biosynthetic assay [J].Marine Ecology Progress，1984，14(2-3)：207-217.

[3]Caputo C，Criado M V，Roberts I N，et al.Regulation of glutamine synthetase 1 and amino acids transport in the phloem of young wheat plants [J].Plant Physiology & Biochemistry，2009，47(5)：335-342.

[4]Thomsen H C，Eriksson D，M?ller I S，et al.Cytosolic glutamine synthetase：a target for improvement of crop nitrogen use efficiency? [J].Trends in Plant Science，2014，19(10)：656-663.

[5]Li Y，Wang M，Zhang F，et al.Effect of post-silking drought on nitrogen partitioning and gene expression patterns of glutamine synthetase and asparagine synthetase in two maize(Zeamays，L.)varieties [J].Plant Physiology & Biochemistry，2016，102：62-69.

[6]Abi-Khalil C，F(xiàn)inkelstein D S，Conejero G，et al.The paralytic shellfish toxin，saxitoxin，enters the cytoplasm and induces apoptosis of oyster immune cells through a caspase-dependent pathway [J].Aquatic Toxicology，2017，190：133-141.

[7]Shin H H，Li Z，Kim E S，et al.Which species，Alexandriumcatenella(Group I)orA.pacificum(Group IV)，is really responsible for past paralytic shellfish poisoning outbreaks in Jinhae-Masan Bay，Korea? [J].Harmful Algae，2017，68(6)：31-39.

[8]林佳寧，顏天，張清春，等.福建沿海米氏凱倫藻赤潮對(duì)皺紋盤鮑鰓組織抗氧化酶活性的影響研究[J].海洋科學(xué)，2016，40(6)：17-22.

[9]Bernard S M，M?ller A L B，Dionisio G，et al.Gene expression，cellular localization and function of glutamine synthetase isozymes in wheat(TriticumaestivumL.)[J].Plant Molecular Biology，2008，67(1-2)：89-105.

[10]Davis B J.Disc electrophoresis.Ⅱ.method and application to human serum proteins [Z].Annals of the New York Academy of Sciences，1964，121(2)：404-427.

[11]Bradford M M A.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding [J].Analytical Biochemistry，1976，72(s1-2)：248-254.

[12]Mann A F，F(xiàn)entem P A，Stewart G R.Tissue localization of barley(Hordeumvulgare)glutamine synthetase isoenzymes [J].FEBS Letters，1980，110(2)：265-267.

[13]Hirel B，Gadal P.Glutamine Synthetase Isoforms in Pea Leaves：Intracellular Localization [J].Zeitschrift Für Pflanzenphysiologie，1981，102(4)：315-319.

[14]Kumada Y，Benson D R，Hillemann D，et al.Evolution of the glutamine synthetase gene，one of the oldest existing and functioning genes [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1993，90(7)：3009-3013.

[15]Amaya K R，Kocherginskaya S A，Mackie R I，et al.Biochemical and mutational analysis of glutamine synthetase type III from the rumen ana erobeRuminococcusalbus8 [J].Journal of Bacteriology，2005，187(21)：7481-7491.

[16]Kleinschmidt J A，Kleiner D.The glutamine synthetase fromAzotobactervinelandii：purification，characterization，regulation and localization [J].European Journal of Biochemistry，1978，89(1)：51-60.

[17]Ahmed S I，Kenner R A，Packard T T.A comparative study of the glutamate dehydrogenase activity in several species of marine phytoplankton [J].Marine Biology，1976，39(1)：93-101.

[18]García-Fernández J，López-Ruiz A，Humanes L，et al.Purification and characterization of glutamine synthetase from the green algaMonoraphidiumbraunii[J].Plant Science，1997，123(1-2)：77-84.

[19]Kim Y J，Yoshizawa M，Takenaka S，et al.Ammonium assimilation inKlebsiellapneumoniaeF-5-2：That can utilize ammonium and nitrate ions simultaneously purification and characterization of glutamate dehydrogenase and glutamine synthetase [J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，93(6)：584-588.

[20]Kameya M，Arai H，Ishii M，et al.Purification and properties of glutamine synthetase fromHydrogenobacterthermophilus，TK-6 [J].Journal of Bioscience & Bioengineering，2006，102(4)：311-315.