黃卓敏 李晴 姚秀華 金平

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACI）伏立諾他（SAHA）聯(lián)合人乳頭瘤病毒16 E7-DNA（HPV16E7-DNA）疫苗治療宮頸癌的效果及免疫機(jī)制。 方法 建立TC-1宮頸癌小鼠模型，負(fù)瘤第5天，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為HPV16E7-DNA組、SAHA組、SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組、對照組，用藥方案：HPV16E7-DNA組給予疫苗5 μg/kg，SAHA組給予SAHA 20 mg/kg，SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組給予疫苗5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg，對照組給予100 μL磷酸鹽溶液（PBS）。每3天1次，共4次。繪制腫瘤生長曲線；流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠外周血CD8+T細(xì)胞的數(shù)量；體外實(shí)驗(yàn)檢測不同劑量SAHA（25.0、12.5 nmol/L）對TC-1細(xì)胞MHCⅠ類分子H-2Kb表達(dá)的影響。 結(jié)果 與其他三組比較，SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組的腫瘤生長速度明顯減慢，小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量增高（P < 0.05）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對照組比較，SAHA組細(xì)胞MHCⅠ類分子H-2Kb的表達(dá)明顯增高（P < 0.05），低劑量與高劑量SAHA組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 HDACI聯(lián)合HPV16E7-DNA疫苗可能通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)，激活機(jī)體CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效應(yīng)，有望用于宮頸癌的免疫治療。

[關(guān)鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶抑制劑；HPV16-E7疫苗；宮頸癌；CD8+T細(xì)胞；MHCⅠ類分子

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（b）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of combination of histone deacetylase inhibitor （HDACI） Suberoylanilide Hydroxamic Acid （SAHA） combined with human papilloma virus 16 E7-DNA （HPV16E7-DNA） vaccine in the treatment of cervical cancer and its immunological mechanism. Methods The model of mice with TC-1 cervical cancer was made， then on the 5th day after tumor bearing， the mice were randomly divided into HPV16E7-DNA group， SAHA group， SAHA and HPV16E7-DNA group， control group by random number table method. The therapeutic regimen was as followed： HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 μg/kg， SAHA group was given SAHA 20 mg/kg， SAHA and HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg， the control group was given 100 μL phosphate solutions （PBS）. Once every 3 days， total for 4 times. The tumor growth curve was drawn； the amount of CD8+T cells in peripheral blood of mice in each group was detected by flow cytometry； the effects of different doses of SAHA （25.0， 12.5 nmol/L） for the expression of H-2Kb of MHC class Ⅰ in TC-1 cells were detected by experiment in vitro. Results Compared with the other three groups， the tumor growth rate in SAHA and HPV16E7-DNA group was significantly slowed down， the amount of HPVE7 specific CD8+T cells in peripheral blood of mice was significantly increased （P < 0.05）. In-vitro experiment showed that compared with control group， the expression of H-2Kb of MHC class Ⅰ in SAHA group was increased significantly （P < 0.05）， while there was no significant difference between low dose of SAHA group and high dose of SAHA group （P > 0.05）. Conclusion HDACI combined with HPV16E7-DNA vaccine comes into significant anti-tumor effects may be through up-regulating expression of MHC class Ⅰ of the tumor cells and activating the immune response of CD8+T cells， which is expected to be used in the immunotherapy of cervical cancer.

[Key words] Histone deacetylase inhibitor； HPV16E7-DNA vaccine； Cervical cancer； CD8+T cells； MHC class Ⅰ

宮頸癌在全球婦女的癌癥死因中居第2位，嚴(yán)重威脅女性健康。高危型人乳頭瘤狀病毒（HR-HPV）是宮頸癌發(fā)生的主要病因，HPV16病毒基因E7是主要致癌基因。宮頸癌傳統(tǒng)的治療包括手術(shù)、放療及化療等，治療創(chuàng)傷大，不能防止HPV再次感染[1]。以HR-HPVE7為靶點(diǎn)研制治療性DNA疫苗，將為宮頸癌的防治開辟一條全新的途徑，但是DNA疫苗本身的免疫原性弱，單獨(dú)應(yīng)用并不能起到良好的抗腫瘤效應(yīng)[2-3]。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACI）與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用，能增加DNA疫苗編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)MHCⅠ、Ⅱ類分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)DNA疫苗的抗腫瘤免疫效應(yīng)[4]。本研究制備HPV16E7-DNA疫苗，聯(lián)合HDACI類藥物伏立諾他（Suberoylanilide Hydroxamic Acid，SAHA）對宮頸癌負(fù)瘤小鼠進(jìn)行免疫治療，探討其對宮頸癌的治療效果及其可能的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來源及培養(yǎng)

小鼠宮頸癌細(xì)胞系TC-1由美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院TC WU教授惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中，0.25%胰酶消化傳代，1～2 d更換培養(yǎng)液。

1.2 HPV16E7-DNA疫苗的制備、純化及檢測

以大腸埃希菌作為表達(dá)載體，pcDNA3.1（+）作為表達(dá)質(zhì)粒，BamHI/XhoI作為限制性核酸內(nèi)切酶，構(gòu)建HPV16E7-DNA疫苗。

1.3 試劑的購買與配制

SAHA購自購于Cayman公司，為白色粉末，使用二甲基亞砜（DMSO）溶液給予溶解稀釋備用。抗PE-HPV16-E7四聚體由商業(yè)公司合成。FITC-CD8a、抗PE-H2Kb均購自商業(yè)公司。藥物及試劑的配制及使用按說明書進(jìn)行。

1.4 宮頸癌負(fù)瘤小鼠模型的建立及免疫治療方案

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用健康近交系C57BL/6小鼠，5周齡，雌性，體重20～30 g，購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0011。按三級動物要求，飼養(yǎng)在無特定病原體環(huán)境中，所用飼料、飲水及墊料均經(jīng)高壓滅菌處理。

1.4.2 動物實(shí)驗(yàn)分組及用藥方案 于小鼠左側(cè)下腹部皮下注射1×105 TC-1細(xì)胞建立宮頸癌模型，負(fù)瘤第5天，小鼠下腹部腫瘤大小約0.5 cm。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為四組（每組10只）：HPV16E7-DNA組、SAHA組、SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組、對照組。用藥方案：HPV16E7-DNA組給予DNA疫苗5 μg/kg；SAHA組給予SAHA 20 mg/kg；SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組給予DNA疫苗5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg；對照組給予磷酸鹽緩沖溶液（PBS）100 μL。每3天1次，共4次。用藥途徑：DNA疫苗給予肌內(nèi)注射；SAHA與PBS給予腹腔注射。

1.5 測量腫瘤生長情況

自負(fù)瘤第5天開始，每3天測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b）至免疫治療結(jié)束第8天，按a×b2/2公式計算腫瘤體積，取各組平均值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量

治療結(jié)束第8天取小鼠尾靜脈血，裂解紅細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，加入抗PE-HPV16-E7四聚體0.5 μL（0.1 μg）與FITC-CD8a 1 μL（0.2 μg），4℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測HPV16-E7四聚體陽性的CD8+T細(xì)胞數(shù)量，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測SAHA對TC-1細(xì)胞MHC1類分子表達(dá)的影響

將TC-1細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔平板，細(xì)胞濃度為2×105/孔，高劑量SAHA組（25.0 nmol/L），低劑量SAHA組（12.5 nmol/L），對照組（PBS），37℃培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，加入抗PE-H-2Kb 0.5 μL（0.1 μg），4℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測各組TC-1細(xì)胞MHC1類分子H-2Kb的表達(dá)，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腫瘤的生長情況

與對照組、HPV16E7-DNA組和SAHA組比較，SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組的腫瘤體積20、23 d明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；對照組、HPV16E7-DNA組和SAHA組三組組間腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)量比較

與對照組、HPV16E7-DNA組和SAHA組比較，SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA組的小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；對照組、HPV16E7-DNA疫苗組和SAHA組三組組間小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1～2。

2.3 SAHA對TC-1細(xì)胞MHC1類分子H-2Kb表達(dá)的影響

與對照組比較，SAHA組細(xì)胞MHCⅠ類分子H-2Kb的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；低劑量與高劑量SAHA組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

3 討論

目前中國每年宮頸癌的新發(fā)病例約13萬，發(fā)病率居世界第二，嚴(yán)重威脅女性健康[5]。以HR-HPV-E7為靶點(diǎn)研發(fā)DNA疫苗，對宮頸癌進(jìn)行免疫治療，為該類疾病的防治開辟新的途徑。DNA疫苗性質(zhì)穩(wěn)定，無MHC限制性，可制成多價疫苗，用于治療多型別HPV感染的宮頸癌。但DNA疫苗的免疫原性弱，而宮頸癌患者的免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生理想的免疫應(yīng)答[6]。近年來，學(xué)者們通過不同的途徑，試圖增強(qiáng)HPV-DNA疫苗的免疫原性[7-8]。

宮頸癌細(xì)胞MHCⅠ類分子表達(dá)下降或缺失，使腫瘤細(xì)胞不能為CD8+T細(xì)胞識別并殺傷，造成免疫逃逸[9]；HR-HPV病毒本身也能逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊而不被清除[10-11]。因此，提高宮頸癌細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)是宮頸癌免疫治療的重要策略。HDACI類藥物SAHA，通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移、降低腫瘤侵襲力等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。研究表明，SAHA與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用，通過增加DNA疫苗編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)MHC分子的表達(dá)，從而產(chǎn)生免疫治療效應(yīng)[13-17]。本研究結(jié)果顯示，SAHA能提高宮頸癌細(xì)胞MHCⅠ類分子H-2Kb的表達(dá)；而在低劑量與高劑量SAHA組之間比較，宮頸癌細(xì)胞MHCⅠ類分子表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。低劑量SAHA即可上調(diào)腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)，說明該藥物的作用是非劑量依賴性的，與文獻(xiàn)報道相符[18]，其機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。低劑量可減輕藥物的不良反應(yīng)，增加藥物的安全性。

本研究顯示，SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA疫苗治療后，小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量明顯升高。HPV16E7-DNA疫苗可激活機(jī)體抗HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞，而SAHA通過提高腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更容易被機(jī)體CD8+T細(xì)胞識別、捕獲和殺傷，SAHA聯(lián)合HPV16E7-DNA疫苗可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，顯著增強(qiáng)小鼠HPV16E7特異性CD8+T細(xì)胞的增殖活化，及其殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。最新文獻(xiàn)報道，SAHA直接作用于HPV16/18 LCR、E6與E7基因，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的生長[19-20]。

綜上所述，HDACI聯(lián)合HPV16E7-DNA疫苗用于治療宮頸癌，可通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)，激活機(jī)體的CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。本研究為臨床宮頸癌的治療開拓了新的思路。關(guān)于HDACI類藥物聯(lián)合HPV16E7-DNA疫苗應(yīng)用于宮頸癌免疫治療的可行性與安全性，仍需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)作深入探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Small W Jr，Bacon MA，Bajaj A，et al. Cervical cancer：a global health crisis [J]. Cancer，2017，123（13）：2404-2412.

[2] Shanmugasundaram S，You J. Targeting Persistent Human Papillomavirus Infection [J]. Viruses，2017，9（8）：229-242.

[3] Lee SJ，Yang A，Wu TC，et al. Immunotherapy for human papillomavirus- associated disease and cervical cancer：review of clinical and translational research [J]. J Gynecol Oncol，2016，27（5）：51-67.

[4] Shen L，Orillion A，Pili R. Histone deacetylase inhibitors as immune modulators in cancer therapeutics [J]. Epigenomics，2016，8（3）：415-428.

[5] Chen W，Zheng R，Baade PD，et al. Cancer statistics in China，2015 [J]. CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[6] Yang A，Jeang J，Cheng K，et al. Current state in the development of candidate therapeutic HPV vaccines [J]. Expert Rev Vaccines，2016，15（8）：989-1007.

[7] Knoff J，Yang B，Hung CF，et al. Cervical Cancer：Development of Targeted Therapies Beyond Molecular Pathogenesis [J]. Curr Obstet Gynecol Rep，2014，3（1）：18-32.

[8] Yang A，Peng S，F(xiàn)armer E，et al. Enhancing antitumor immunogenicity of HPV16-E7 DNA vaccine by fusing DNA encoding E7-antigenic peptide to DNA encoding capsid protein L1 of Bovine papilloma virus [J]. Cell Biosci，2017， 7：46.