葛慶豐,丁祺祺,陳 勝,楊祥凡,尹永祺,賈鐵平,吳滿剛,于 海,*

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127;2.江蘇省淮揚(yáng)菜產(chǎn)業(yè)化工程中心,江蘇揚(yáng)州 225127;3.江蘇萬(wàn)力生物科技有限公司,江蘇東臺(tái) 224200)

豬腸膜蛋白(dried porcine soluble,DPS)是一種營(yíng)養(yǎng)性動(dòng)物蛋白原料,由豬腸膜水解制得[1]。DPS具有小肽及游離氨基酸含量豐富、動(dòng)物吸收利用率高及適口性好等營(yíng)養(yǎng)特性,研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加DPS粉可顯著提高仔豬日增重、減少斷奶應(yīng)激并降低死亡率[2]。因此,目前DPS粉已被廣泛用于動(dòng)物生產(chǎn)中，尤其是仔豬斷奶及保育階段日糧生產(chǎn)[3]。

由于化學(xué)水解法難以控制豬腸膜水解程度、易破壞氨基酸結(jié)構(gòu)且需去除酸堿溶劑,而酶解豬腸膜法不僅可保持原料蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而釋放出不同鏈長(zhǎng)的生物活性肽,同時(shí)生產(chǎn)成本及污染程度低,其已成為DPS粉制備工藝中的研究熱點(diǎn)[4-7]。舒夏娃采用雙酶分段水解工藝,得到水解腸粘膜最佳工藝參數(shù),制備出低分子肽含量較高的腸粘膜蛋白粉產(chǎn)品[8]。王春維等[9]初步研究了木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)豬腸粘膜水解效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木瓜蛋白酶優(yōu)于胰蛋白酶,酶解工藝條件為:水解時(shí)間7 h,溫度60 ℃,酶加量2%。目前國(guó)內(nèi)外豬腸膜的研究開(kāi)發(fā)較少,對(duì)酶解制備工藝優(yōu)化方面沒(méi)有進(jìn)行深入探討。

在我國(guó)眾多肝素生產(chǎn)企業(yè)中,腸粘膜提取肝素后的下腳料一般作為廢棄物隨污水直接排放[10],不僅造成蛋白資源的大量浪費(fèi),而且由于傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝,會(huì)產(chǎn)生腥臭、污水,污染環(huán)境[11]。近幾年來(lái),選用生物價(jià)值不高的副產(chǎn)物及食品工業(yè)的廢水、廢物為原料,制備一系列功能各異的生物活性物質(zhì)已經(jīng)成為食品領(lǐng)域的研究趨勢(shì)。腸粘膜作為腸衣生產(chǎn)加工過(guò)程中的副產(chǎn)物,富含蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)總量高達(dá)60%,具有極高的研究?jī)r(jià)值[9]。因此,本實(shí)驗(yàn)以天然腸衣加工副產(chǎn)物腸粘膜為原料,以產(chǎn)品可溶性蛋白含量為指標(biāo),通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化腸粘膜蛋白粉的制備工藝參數(shù),篩選適合用于酶解腸粘膜的蛋白酶,旨在實(shí)現(xiàn)動(dòng)物副產(chǎn)資源的循環(huán)利用,從源頭減量排放減少環(huán)境污染,節(jié)約飼料生產(chǎn)成本,推動(dòng)腸粘膜蛋白粉在國(guó)內(nèi)飼料中的廣泛應(yīng)用,產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸粘膜(腸衣加工過(guò)程中的廢棄物) 江蘇聯(lián)眾腸衣有限公司;木瓜蛋白酶(酶活>1000 U/mg),胰蛋白酶(酶活>250 U/mg),胃蛋白酶(酶活>3000 U/mg) 上海藍(lán)季生物有限公司;鄰苯二甲醛、甲醇、十二烷基硫酸銨(SDS)、β-巰基乙醇、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

INFINITE 200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan集團(tuán)有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SX-500自動(dòng)蒸汽消毒柜 日本TOMY公司;W201恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術(shù)有限公司;BCD-215DF電冰箱 青島海爾股份有限公司;Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Fisher科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腸粘膜蛋白粉的制備 稱取一定質(zhì)量腸粘膜溶于緩沖液中,1×104r/min勻漿10 s,根據(jù)不同蛋白酶最適水解條件對(duì)腸粘膜進(jìn)行水解,水解結(jié)束后沸水浴滅活5 min,4000 r/min離心15 min,取上清液冷凍干燥,最后在干燥皿中保存腸粘膜蛋白粉。

1.2.2 可溶性蛋白含量測(cè)定 用福林-酚法測(cè)定腸粘膜可溶性蛋白含量[12]。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:稱取250 μg牛血清蛋白,溶于1 mL蒸餾水中,配成250 μg/mL的牛血清蛋白溶液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液于帶塞試管中,再分別加入蒸餾水到1 mL。每個(gè)試管各加5.0 mL試劑甲,混勻后室溫放置10 min,加入0.5 mL試劑乙,立即混勻,室溫反應(yīng)30 min,在600 nm處測(cè)吸光值,以O(shè)D600為縱坐標(biāo),蛋白含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=1.2602x+0.8106,R2=0.9985。

1.2.2.2 可溶性蛋白含量的計(jì)算 取0.5 mL酶解液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟操作,由回歸方程計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的牛血清蛋白的數(shù)量從而得到可溶性蛋白含量。

樣品中蛋白含量(%)=[X(μg/mL)×樣品總體積(mL)×100]/[樣品重量(g)×106]

1.2.3 蛋白酶篩選 選擇木瓜蛋白酶,胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)腸粘膜進(jìn)行水解,以可溶性蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選合適蛋白酶,具體水解條件如表1所示。

表1 蛋白酶的選擇Table 1 The choice of protease

1.2.4 水解工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在篩選出最適蛋白酶基礎(chǔ)上,保持其他條件不變,分別研究水解時(shí)間、蛋白酶添加量和液固比對(duì)酶解液中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。

水解時(shí)間:固定液固比為3 mL/g,蛋白酶添加量為5000 U/g蛋白,分別水解3、4、5、6、7、8 h,測(cè)定可溶性蛋白含量。

蛋白酶添加量:固定液固比為3 mL/g,水解時(shí)間為6 h,蛋白酶添加量分別為1000、2000、3000、4000、5000、6000 U/g蛋白,測(cè)定可溶性蛋白含量。

液固比:固定水解時(shí)間6 h,蛋白酶添加量為5000 U/g蛋白,液固比分別為1、2、3、4、5、6 mL/g,測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.2.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用3因素3水平的Box-Behnken[13-14]設(shè)計(jì),考察水解時(shí)間、酶添加量和液固比3個(gè)因素對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響,實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2,以可溶性蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值,通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件,采用Design-expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,建立二次線性回歸方程,預(yù)測(cè)最佳工藝參數(shù)[15-17]。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Variables and their levels and actualvalues employed in Box-Behnken design

1.3 數(shù)據(jù)分析

各指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SigmaPlot軟件繪制散點(diǎn)圖,使用DPS軟件進(jìn)行顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)差分析,運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

蛋白酶具有特異性、專一性的特點(diǎn),因此不同蛋白酶對(duì)腸粘膜的水解效果不同[18]。由圖1可以看出,木瓜蛋白酶制備得到的腸粘膜蛋白粉可溶性蛋白含量為7.37%±0.06%顯著高于(p<0.05)胰蛋白酶和胃蛋白酶;木瓜蛋白酶屬于半胱氨?；鞍酌?能夠降解膠原纖維和結(jié)締組織蛋白質(zhì),將肌動(dòng)蛋白和膠原蛋白降解成為小分子的多肽[19],其在肉類食品中的應(yīng)用十分廣泛[20]。因此選用木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶對(duì)可溶性蛋白含量的影響Flg.1 Effects of different protease on soluble protein content

2.2 木瓜蛋白酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 水解時(shí)間對(duì)可溶性蛋白含量的影響 如圖2所示,隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),酶解液中可溶性蛋白含量逐漸增加,水解7 h時(shí),其可溶性蛋白含量最高為15.20%±0.04%,隨后緩慢降低。這是因?yàn)樗獬跗陔A段,底物和蛋白酶充分酶解,酶解產(chǎn)物的可溶性蛋白含量增加;隨水解時(shí)間延長(zhǎng),酶解液中肽鍵進(jìn)一步斷裂,導(dǎo)致可溶性蛋白含量降低。賈韶千等[21]以DPPH自由基清除率為指標(biāo)研究水解時(shí)間對(duì)黃鱔魚多肽水解效果的影響,發(fā)現(xiàn)水解時(shí)間延長(zhǎng),水解反應(yīng)中的一些肽段被再次水解,導(dǎo)致水解效果降低。選擇水解時(shí)間7 h作為最適水解時(shí)間。

圖2 水解時(shí)間對(duì)腸粘膜可溶性蛋白含量的影響Flg.2 Effects of hydrolysis time on the soluble protein content of intestinal mucosa

2.2.2 酶添加量對(duì)可溶性蛋白含量的影響 如圖3所示,隨著木瓜蛋白酶添加量的增加,腸粘膜可溶性蛋白含量增加,這是因?yàn)槊柑砑恿吭蕉?底物反應(yīng)越徹底,酶添加量為5000 U/g蛋白時(shí),可溶性蛋白含量最大為15.59%±0.05%。繼續(xù)添加蛋白酶時(shí),底物已經(jīng)充分水解,可溶性蛋白含量反而下降,可能因?yàn)槭抢^續(xù)增加酶添加量,導(dǎo)致酶自身水解,酶活力降低,進(jìn)而影響可溶性蛋白含量[22]。程水明等[23]在木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白工藝的優(yōu)化一文中指出,酶添加量過(guò)高時(shí),由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng),會(huì)抑制酶對(duì)底物的水解;當(dāng)酶添加量較小時(shí),主要為酶控反應(yīng),隨著酶添加量的增加,水解效果會(huì)越好。因此選擇酶添加量5000 U/g進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶添加量對(duì)腸粘膜可溶性蛋白含量的影響Flg.3 Effects of enzyme addition on soluble protein content of intestinal mucosa

2.2.3 液固比對(duì)可溶性蛋白含量的影響 如圖4所示,隨著液固比的增加,腸粘膜可溶性蛋白含量增加,這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時(shí),只有一部分酶與底物結(jié)合,隨著底物濃度增加,酶與底物充分反應(yīng),中間產(chǎn)物增多;當(dāng)液固比較大時(shí),使得蛋白酶有效濃度降低,從而不利于蛋白水解。趙世光等[24]研究液固比酶法制備芝麻多肽的影響,發(fā)現(xiàn)多肽產(chǎn)率達(dá)到最高值時(shí)繼續(xù)增加液固比后,多肽產(chǎn)率增幅不明顯。液固比能反應(yīng)溶質(zhì)在溶劑中的溶解狀況,液固比較小時(shí),反應(yīng)體系黏度大,不利于蛋白酶與腸粘膜蛋白組分的接觸,水解反應(yīng)受到抑制,水解效果不佳;液固比較大時(shí),降低了體系的黏度,促進(jìn)了酶與蛋白之間的作用,可溶性蛋白含量增加。因此最適液固比為4 mL/g。

圖4 液固比對(duì)腸粘膜可溶性蛋白含量的影響Flg.4 Effects of liquid quality on soluble protein content of intestinal mucosa

2.3 酶解條件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面模型的建立與方差分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇水解時(shí)間、酶添加量、液固比3個(gè)因素為變量,可溶性蛋白含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到描述酶解液中可溶性蛋白含量(Y)與自變量酶解時(shí)間(A)、酶添加量(B)和液固比(C)的二次多項(xiàng)回歸擬合方程:

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

Y=15.42-0.30A+0.64B-1.21C-.090AB-0.59AC+0.10BC-0.71A2-1.26B2-2.14C2。

由表4可知,B、AB、AC、A2、B2和C2項(xiàng)的F檢驗(yàn)呈顯著性,模型的p值顯著,且失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明方程的擬合是充分的,相關(guān)系數(shù)R2=0.9714,說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較高的相關(guān)性,所以此模型能夠描述木瓜蛋白酶酶解條件對(duì)腸粘膜的水解變化規(guī)律,能較好的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model variance analysis

2.3.2 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化 根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)回歸分析所得的二次回歸方程,作出響應(yīng)面圖和等高線圖,可在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)分析各變量之間的變化關(guān)系(圖5～圖7)。

圖5為固定液固比4 mL/g,酶添加量和水解時(shí)間對(duì)腸粘膜可溶性蛋白含量的影響。由圖所示,隨著酶添加量的增加和水解時(shí)間的延長(zhǎng),可溶性蛋白的含量升高,其中,酶添加量對(duì)可溶性蛋白含量的影響較大。酶添加量在-0.5～1水平,水解時(shí)間在-1～0.5水平范圍內(nèi),可溶性蛋白含量可獲得最大值。

圖5 酶添加量和水解時(shí)間對(duì)腸粘膜可溶性蛋白影響的等值線圖和3D響應(yīng)曲面圖Flg.5 The contour map and 3D response surface map of the soluble protein of intestinal mucosa were affected by enzyme addition and hydrolysis time

圖6為固定水解時(shí)間7 h,液固比和酶添加量對(duì)可溶性蛋白含量的影響。由圖所示,隨著液固比和酶添加量的增加,可溶性蛋白的含量先升高后下降,其中,液固比對(duì)可溶性蛋白含量的影響較大。液固比在-1～0.5水平,可溶性蛋白含量隨液固比增大而迅速增加,之后可溶性蛋白曲面緩慢下降。由等值線可見(jiàn),液固比在-0.8～0.3水平,酶添加量在-0.5～1水平范圍內(nèi),可溶性蛋白含量有最大值。

圖6 液固比和酶添加量對(duì)腸粘膜可溶性蛋白影響的等值線圖和3D響應(yīng)曲面圖Flg.6 The contour map and 3D response surface map of the soluble protein of intestinal mucosa were affected by liquid ratio and enzyme

圖7為固定酶添加量5000 U/g蛋白,液固比和水解時(shí)間對(duì)可溶性蛋白含量的影響。由圖所示,隨著液固比和酶添加量的增加,可溶性蛋白的含量先升高后下降,其中,水解時(shí)間對(duì)可溶性蛋白含量的影響較小[25-26]。

圖7 液固比和水解時(shí)間對(duì)腸粘膜可溶性蛋白影響的等值線圖和3D響應(yīng)面圖Flg.7 The contour map and 3D response surface of the soluble protein of intestinal mucosa were affected by the liquid ratio and hydrolysis time

由響應(yīng)面軟件分析預(yù)測(cè)得到最大的響應(yīng)值(Y)時(shí),因子A、B、C對(duì)應(yīng)的編碼值分別為A=6.56、B=5372.12、C=1∶3.78,其所對(duì)應(yīng)的木瓜蛋白酶生產(chǎn)腸膜蛋白粉的最佳工藝為:酶添加量為5372.12 U/g蛋白,水解時(shí)間為6.65 h,液固比為3.78 mL/g,可溶性蛋白含量最高為15.92%。

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳酶解條件并考慮實(shí)際操作,修正工藝條件為:酶添加量5400 U/g蛋白,水解時(shí)間6.5 h,液固比4 mL/g,得到實(shí)驗(yàn)可溶性蛋白含量為15.81%±0.04%,與理論值相差0.75%。因此,響應(yīng)面法對(duì)腸粘膜蛋白粉生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化具有可行性。

3 結(jié)論

以可溶性蛋白含量為指標(biāo),確定木瓜蛋白酶為最適用酶。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解豬小腸粘膜的工藝條件。確定最佳腸粘膜蛋白粉制備條件為:水解時(shí)間6.5 h、酶添加量5400 U/g、液固比為4 mL/g,在此條件下得到的水解產(chǎn)物可溶性蛋白含量為15.81%±0.04%。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)天然腸衣加工副產(chǎn)物-腸粘膜的利用開(kāi)發(fā)具有參考價(jià)值。

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