梁姝敏,吳正奇,*,許 琦,張云天,余 攀

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068;2.湖北工業(yè)大學(xué)土木建筑與環(huán)境學(xué)院,湖北武漢 430068)

瑪咖(Maca,LepidiummeyeniiWalp.)是一種十字花科(Brassicaceae)獨(dú)行菜屬(Lepidium)一年生藥食兩用草本植物,在增強(qiáng)生育力、提高精力、抗疲勞和改善內(nèi)分泌等方面負(fù)有盛名[1-4]。瑪咖含有蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,還含有瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷、綠原酸以及甾醇等活性成分[3]。其中瑪咖含有18種氨基酸,其中必需氨基酸占總氨基酸的36.75%。瑪咖蛋白質(zhì)含量豐富,含量為10.2%～18%[5]。

大量的研究表明,多肽具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、降膽固醇和降血脂、降血壓、抑菌以及抗氧化等方面的功能[6-9]。提取多肽常用的手段有分離提取法、化學(xué)合成法、基因重組法、水解法和微生物發(fā)酵法[10]。然而目前關(guān)于瑪咖多肽報道僅有羅彤[11]采用堿溶酸沉法提取瑪咖蛋白質(zhì)后酶解制備瑪咖多肽,并對瑪咖多肽的抗疲勞活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖干粉 產(chǎn)自新疆瑪咖種植基地的黃瑪咖干燥磨粉過40目篩;酸性蛋白酶(酶活力5×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力5×104U/g) 南寧東恒華道生物技術(shù)有限公司;中性蛋白酶(酶活力2×106U/g) 武漢市華順生物技術(shù)有限公司;堿性蛋白酶(酶活力1.6×105U/g) 諾維信生物技術(shù)有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)室常用有機(jī)試劑和無機(jī)試劑,無特殊說明均為國產(chǎn)分析純或國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。

HYP-308消化爐、KDN-102F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SYZ-B型石英亞沸高純水蒸餾器 常州國華電器有限公司;UV-6100雙光束型紫外可見分光光度計 上海美普達(dá)儀器有限公司;ST2100 pH計 奧豪斯儀器有限公司;TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瑪咖醇提液的制備 工藝流程:稱取瑪咖干粉→料液比1∶10 (g∶mL)55%乙醇85 ℃回流提取1 h,提取兩次→3500 r/min×10 min離心分別收集上層液體和下層沉淀,上層液體即為瑪咖醇提液

瑪咖多肽的制備工藝流程:取上述工藝中得到的下層沉淀→適量水溶解→95 ℃,高溫α-淀粉酶酶解2 h→5000 r/min×15 min離心得到瑪咖粗蛋白沉淀→少量水洗滌沉淀→復(fù)溶于水→蛋白酶酶解→煮沸滅酶→5000 r/min×15 min離心取上層瑪咖多肽水相→真空冷凍干燥,凍干物即為瑪咖多肽。

1.2.2 水解最適酶的選擇 以水解度為指標(biāo),測定相同加酶量下的不同種類酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶)對瑪咖粗蛋白水解程度的影響,確定最適宜的蛋白酶,參考文獻(xiàn)[10]加酶量為8×103U/g。參考每種酶的產(chǎn)品說明書,對應(yīng)的最適酶解pH及酶解溫度見表1。蛋白質(zhì)含量的測定采用食品中蛋白質(zhì)的測定方法——凱氏定氮法GB5009.5-2010。蛋白質(zhì)水解度測定采用甲醛滴定法[12]。

表1 不同種類酶作用的條件Table 1 Conditions of different enzymes

1.2.3 酶解條件優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn) 最適酶分別在酶解時間0.5、1、2、3、4 h,酶解pH10,酶解溫度50 ℃,加酶量8×103U/g條件下,探究酶解時間對瑪咖粗蛋白的水解度影響。最適酶分別在酶解時間2 h,酶解pH9、9.5、10、10.5、11,酶解溫度50 ℃,加酶量8×103U/g條件下,探究酶解pH對瑪咖粗蛋白的水解度影響。最適酶分別在酶解時間2 h,酶解pH10,酶解溫度40、45、50、55、60 ℃,加酶量8×103U/g條件下,探究酶解溫度對瑪咖粗蛋白的水解度影響。最適酶分別在酶解時間2 h,酶解pH10,酶解溫度50 ℃,加酶量3.2×103、6.4×103、9.6×103、1.28×104、1.6×104U/g條件下,探究加酶量對瑪咖粗蛋白的水解度影響。所有實(shí)驗(yàn)組別均按照1.2.1所述工藝進(jìn)行。

1.2.4 酶解條件優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計4因素3水平正交實(shí)驗(yàn),因素水平設(shè)計見表2,優(yōu)化瑪咖多肽提取工藝條件。選取加酶量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH 4個因素,設(shè)計9組不同組合實(shí)驗(yàn),從中篩選出最佳提取條件。

表2 酶解瑪咖粗蛋白的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 2 Design of orthogonal experiment of enzymolysis on Maca protien

1.2.5 瑪咖多肽純度的測定

瑪咖多肽純度(%)=(瑪咖多肽凍干粉蛋白質(zhì)量/瑪咖凍干粉質(zhì)量)×100

式(1)

1.2.6 瑪咖多肽抗氧化能力的測定

1.2.6.1 OH·清除能力的測定(Fenton法) 將配制好的一定濃度梯度的待測液2 mL分別置于10 mL比色管中(取一份蒸餾水作空白對照),加入5 mmol/L FeSO4和5 mmol/L H2O2各2 mL,搖勻,迅速加入2 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,立即置于37 ℃水浴保溫60 min后,于510 nm處測定吸光值。

OH·清除率(%)=100%×[1-(Aj-Ai)/A0]

式(2)

式(2)中,A0-2 mL FeSO4+2 mL H2O2+2 mL水楊酸-乙醇+2 mL蒸餾水的吸光值;Ai-2 mL待測液+2 mL水楊酸-乙醇+4 mL蒸餾水的吸光值;Aj-2 mL待測液+2 mL FeSO4+2 mL H2O2+2 mL水楊酸-乙醇的吸光值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力的測定 將配制好的一定濃度梯度的待測液4 mL分別置于10 mL比色管中(取一份蒸餾水作空白對照),加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液,混勻后避光30 min,于517 nm波長測定其吸光值。

DPPH·清除率(%)=[1-(Bj-Bi)/B0]×100

式(3)

式(3)中,B0-4 mL DPPH·乙醇溶液+4 mL蒸餾水的吸光值;Bi-4 mL待測液+4 mL DPPH·乙醇溶液的的吸光值;Bj-4 mL待測液+4 mL無水乙醇的吸光值。

式(4)

式(4)中,C0-對照管的吸光值;Ci-測定管的吸光值。

1.2.7 瑪咖多肽的氨基酸組成分析 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》測定瑪咖多肽的氨基酸組成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)分析的數(shù)據(jù)是三組平行實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用軟件OriginPro 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

在酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶各自最適反應(yīng)條件下,測定四種酶對瑪咖粗蛋白的水解度。結(jié)果如圖1,水解度分別6.51%,8.30%,18.67%,6.32%。其中,堿性蛋白酶對瑪咖粗蛋白的水解程度最大,說明堿性蛋白酶是酶解瑪咖粗蛋白的最適宜的酶。

圖1 不同酶作用下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.1 Maca protein DH hydrolyzed by different enzyme

2.2 酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解溫度對水解度的影響 由圖2可以看出,隨著酶解溫度的提高,水解度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當(dāng)溫度在40 ℃升至50 ℃時,水解率隨溫度的升高而增加;在50 ℃時,水解度到達(dá)最大值,為18.67%;當(dāng)溫度繼續(xù)升高至60 ℃時,水解度減小。所以,最優(yōu)酶解溫度為50 ℃。分析原因:當(dāng)溫度低時,酶活性隨著溫度增加而增加,當(dāng)溫度達(dá)到酶解的最適溫度時酶活性最強(qiáng)。隨著溫度持續(xù)升高至超過最適溫度,酶可能會失活,所以酶活降低,水解度減小[13]。

圖2 不同酶解溫度下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.2 Maca protein DH hydrolyzed by different temperature

2.2.2 pH對水解度的影響 由圖3可以看出,水解度隨著pH的增大,呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)pH從9增大至10時,水解度不斷增大;在pH10時達(dá)到最大值為18.55%;當(dāng)pH繼續(xù)增大至11時,水解度逐漸減小。所以,最優(yōu)pH為10。分析原因:pH會影響堿性蛋白酶及蛋白質(zhì)分子某些基團(tuán)的解離狀態(tài),從而導(dǎo)致堿性蛋白酶活性降低。

圖3 不同酶解pH下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.3 Maca protein DH hydrolyzed by different pH

2.2.3 加酶量對水解度的影響 由圖4可以看出,隨著加酶量的增加,水解度先大幅增加后趨于平緩。當(dāng)加酶量為1.6×104U/g時,水解度達(dá)到最大值,為22.48%。所以,最優(yōu)加酶量為1.6×104U/g。分析原因:隨著加酶量增加,酶解速率加快,對底物消耗更快;達(dá)到一定值時,底物幾乎被完全酶解。此種情況下,再加大加酶量對底物的水解度影響不大。

圖4 不同加酶量下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.4 Maca protein DH hydrolyzed by different ratio of enzyme

2.2.4 酶解時間對水解度的影響 由圖5可知,水解度隨著時間的增加而增大,最后基本穩(wěn)定在一定的水平。所以,最優(yōu)酶解時間為4 h。分析原因:隨著時間的延長,底物不斷地被酶解消耗,因此水解率也在不斷地增加。當(dāng)?shù)孜锉煌耆夂?水解度便不再增加。

圖5 不同酶解時間下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.5 Maca protein DH hydrolyzed by different time

2.3 酶解的正交實(shí)驗(yàn)

按照表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),對瑪咖多肽的水解條件進(jìn)行優(yōu)化,考察加酶量、酶解溫度、酶解pH以及酶解時間4個因素對水解度的影響,結(jié)果見表3。由表3可以看出影響水解度的各因素有主到次的排序分別為酶解時間、酶解pH、酶解溫度、加酶量。最優(yōu)酶解組合為A3B3C3D3,即加酶量1.6×104U/g、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH為10.5,在此條件下,做三組平行實(shí)驗(yàn),水解度最高,為(31.55%±0.74%)。采用凱氏定氮法分析,最適條件下提取后凍干得到瑪咖多肽純度為54.71%。

表3 酶解瑪咖粗蛋白正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析Table 3 Results of orthogonal experiment of enzymolysis on Maca protein

2.4 瑪咖醇提液抗氧化活性測定

圖6 瑪咖醇提液的抗氧化能力Fig.6 Antioxidant activity of Maca alcohol

2.5 瑪咖多肽抗氧化活性測定

2.5.1 瑪咖多肽對·OH的清除能力 不同濃度的瑪咖多肽液(在最適條件條件下獲得)和VC溶液對·OH清除能力如圖7所示。從圖中可以看出,瑪咖多肽對·OH的清除能力隨濃度增加而增加,在濃度為2 mg/mL時,對·OH的清除率最大,為89.56%。VC溶液在濃度為1.5 mg/mL時對·OH的清除率最大,為99.81%?，斂Ф嚯暮蚔C溶液清除·OH的IC50值分別為0.85和0.44 mg/mL。

圖7 瑪咖多肽對羥自由基的清除能力Fig.7 OH· radical scavenging ability of Maca peptide

2.5.2 瑪咖多肽對DPPH自由基的清除能力 不同濃度的瑪咖多肽(在最適條件下獲得)和VC溶液對DPPH自由基清除能力如圖8所示。從圖中可以看出濃度高于0.5 mg/mL時,二者對DPPH自由基的清除率基本都保持不變。瑪咖多肽在濃度為0.5 mg/mL時對DPPH自由基的清除率最大,為79.04%?，斂Ф嚯暮蚔C溶液清除DPPH自由基的IC50值分別為0.44和0.32 mg/mL。二者對DPPH自由基都具有明顯的清除作用。

圖8 瑪咖多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging ability of Maca peptide

圖9 瑪咖多肽對超氧陰離子自由基的清除能力 radical scavenging ability of Maca peptide

2.6 瑪咖多肽的氨基酸組成分析

對瑪咖多肽進(jìn)行氨基酸組成分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知,瑪咖多肽含有17種氨基酸(不包含色氨酸),其中,必需氨基酸占總氨基酸含量的37.50%。構(gòu)成肽的氨基酸種類和數(shù)量影響著多肽的抗氧化能力的大小。許多氨基酸及其衍生物有清除自由基的能力,如:Lys、His、Tyr、Met、Pro、Arg、Glu、Cys等,而且含有Tyr、His、Lys、Pro等氨基酸的多肽一般具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17]。此外,多肽的氨基酸排列對其抗氧化活性也具有一定影響,如:His-His的N末端增加一個Leu或Pro能夠增強(qiáng)二肽的抗氧化活性和促進(jìn)與非肽類抗氧化劑的協(xié)同作用[18]?，斂Ф嚯闹蠺yr、His、Lys、Pro四種氨基酸含量為16.98%,可以推斷,瑪咖多肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力可能與其含有的這些氨基酸有關(guān)。但其具體的分子質(zhì)量分布及氨基酸排列,仍需要進(jìn)一步分離純化后確定。

表4 瑪咖多肽的氨基酸組成及含量Table 4 Amino acid composition of Maca peptide

3 結(jié)論

抗氧化活性肽能夠清除自由基、終止單線態(tài)氧的生成、螯合促氧化的過渡金屬離子,而且因?yàn)榉肿恿啃?，易于消化吸收[19],因此,對瑪咖多肽的研究為天然抗氧化劑和功能食品領(lǐng)域提供了新的可能。

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