付大偉,陳啟蒙,徐 偉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

T4 DNA連接酶(T4 DL)是基因工程技術(shù)中一種重要的工具酶,在體外可在ATP輔助下,催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的連接[1-2],是DNA 復(fù)制過(guò)程中復(fù)制鏈的合成所必需的,廣泛應(yīng)用于體外 DNA連接、載體制備以及核酸分析等領(lǐng)域[3-5]。

傳統(tǒng)的重組蛋白純化方法是鎳柱法,但存在操作程序繁瑣、介質(zhì)昂貴、純化量少等問(wèn)題,只適應(yīng)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小量樣品制備[6]。隨著蛋白純化技術(shù)的不斷發(fā)展,近年來(lái)研發(fā)了磁珠法[7],因其操作簡(jiǎn)單、成本低廉、特異性強(qiáng)、純化量大等,可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)樣品等[8-9],但目前磁珠純化法應(yīng)用于重組蛋白純化的研究較少。

目前,平末端PCR產(chǎn)物的連接,會(huì)出現(xiàn)平末端連接效率低,假陽(yáng)性菌落多等現(xiàn)象,為解決這些問(wèn)題,傳統(tǒng)的方法是載體末端去磷酸化后再進(jìn)行連接反應(yīng),但其存在操作繁瑣,DNA 損失量較大,降低連接效率等問(wèn)題,已成為急需解決的問(wèn)題。

本文構(gòu)建了含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合標(biāo)簽的重組表達(dá)載體,通過(guò)自誘導(dǎo)表達(dá)[10-11]及磁珠純化法檢測(cè),篩選出高效表達(dá)的重組菌Transetta(DE3)(pNBEVII-T4 DL),并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)及方差分析法確定重組菌的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。比較 MagNi 磁珠法與鎳柱法對(duì)融合蛋白Trx-T4 DL的純化效果,為磁珠法應(yīng)用于重組蛋白的純化提供理論依據(jù)。檢測(cè)獲得的融合蛋白Trx-T4 DL的連接活性,并與 T4 DNA焦磷酸激酶協(xié)同作用于低背景克隆載體的構(gòu)建中,以提高連接效率和陽(yáng)性率,為平末端PCR產(chǎn)物的連接提供一種新方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Transetta(DE3)菌株、HiFi DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、DNA Marker和EcoR V 北京全式金生物技術(shù)有限公司;Trans I菌株和E.coliBL21(DE3)菌株 實(shí)驗(yàn)室保存;本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒及其特性說(shuō)明見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室所用質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this work

限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、Not I和Hind Ⅲ NEB公司;一步法克隆試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司;異丙基硫化-β-半乳糖苷(IPTG) Sigma公司;氨芐青霉素(Ampr)、卡那霉素(Kana)、氯霉素(Cmr)三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、Triton X-100、苯甲基磺酰氟(PMSF) Taraka公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒D2500-01、GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit 美國(guó)Omega公司;Ni-NTA柱 Novagen公司;蛋白質(zhì)marker Thermo公司;MagNi Protein Purification Kit、脫鹽柱 北京諾貝奧生物技術(shù)有限公司。

T100 TM Thermal Cycler PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;H1650-W臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;GDS8000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;W201B恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術(shù)有限公司;DW-86L388A立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司;DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-311C落地恒溫振蕩器 上海恒一科學(xué)儀器有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 T4 DL基因的擴(kuò)增及克隆載體構(gòu)建 根據(jù)T4 DL的基因在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的序列(EU118292)及所需載體的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)引物,在上、下游引物的5′端分別加入了BamH I和Not I酶切位點(diǎn)。

上游引物P1:5′-TGTATTTTCAGGGAGGATCC ATGATTCTTAAAATTCTGAACGAAATAGC-3′,下游引物P2:5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCA TAGACCAGTTACCTCATGAAAATC-3′(下劃線代表酶切位點(diǎn)),引物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。以提取的T4噬菌體(T4 bacteriophage)的基因組為模板,利用上述P1、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。通過(guò)一步法將純化產(chǎn)物與經(jīng)BamH I和Not I酶切后的pET-22b(+)表達(dá)載體連接,構(gòu)建重組載體 pET-22b(+)-T4 DL,并直接轉(zhuǎn)化到E.coliTrans I克隆感受態(tài)細(xì)胞中,利用T7和P2引物進(jìn)行菌落 PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆,反應(yīng)條件為:95 ℃,5 min;95 ℃,30 s;50 ℃,40 s;72 ℃,1 min;34個(gè)循環(huán);72 ℃,5 min;終止反應(yīng),再利用BamH I和Not I雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆,并將其送到上海生工生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建 按1.2.1中方法把測(cè)序成功的T4 DL基因與不同融合蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體通過(guò)一步法進(jìn)行連接,構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到E.coliTrans I感受態(tài)中,涂布于含Ampr的LB平板上,按1.2.1中方法鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.3 自誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白的可溶性表達(dá)

1.2.3.1 重組菌的自誘導(dǎo)表達(dá) 分別將檢測(cè)成功的重組載體轉(zhuǎn)化到E.coliTransetta(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含Ampr及Cmr的LB固體培養(yǎng)基上,挑取單個(gè)菌落,接種于含Ampr和Cmr的1 mL LB 培養(yǎng)液中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,再按1‰(V/V)的接種量接種于10 mL ZYP+5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[14-15],37 ℃,150 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)14 h,離心收集菌體,10% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.3.2 融合蛋白的可溶性檢測(cè) 取1.2.3.1中誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌液1 mL,12000 r/min離心5 min,收集菌體,按MagNi Protein Purification Kit的說(shuō)明書進(jìn)行純化。取沉淀、上清、穿透、洗脫液進(jìn)行10% SDS-PAGE分析,選出表達(dá)量較高的菌株。

1.2.4 重組菌E.coliTransetta(DE3)(pNBEVII-T4 DL)培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn) 選擇影響發(fā)酵的4種培養(yǎng)條件:溫度、接種量、pH、裝瓶量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,按1.2.4.5方法進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果取無(wú)顯著差異的數(shù)值的平均值,確定各因素的最佳條件[12]。

1.2.4.1 培養(yǎng)溫度的篩選 接1‰(V/V)菌種于裝有初始pH7的10 mL ZYM-5052 Ampr和Cmr培養(yǎng)基的 50 mL三角瓶中,16、25、30、37、42 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,篩選出最適溫度。

1.2.4.2 接種量的篩選選擇 不同接種量:1‰、5‰、10‰、15‰、20‰、30‰(V/V)接菌種于裝有初始pH為7的10 mL ZYM-5052 Ampr和Cmr培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,37 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,篩選出最適接種量。

1.2.4.3 初始pH的篩選 接1‰(V/V)菌種于裝有初始pH分別為5、6、7、8、9的10 mL ZYM-5052 Ampr和Cmr培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,37 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,篩選出最適接PH。

1.2.4.4 裝瓶量的篩選 接1‰(V/V)菌種于裝有初始pH為7的 25、50、75、100、150 mL ZYM-5052 Ampr和Cmr培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,篩選出最適瓶裝量[12]。

1.2.4.5 分析方法 菌體密度的測(cè)定:取1.2.3中菌液稀釋合適倍數(shù),用分光光度計(jì)測(cè)定 600 nm 處的吸光值,其乘以稀釋倍數(shù)即發(fā)酵液的菌體密度(OD600);融合蛋白Trx-T4 DL的可溶性檢測(cè):按1.2.3.2中方法檢測(cè),取樣進(jìn)行10% SDS-PAGE分析及Bandscan軟件分析蛋白可溶性表達(dá)量;可溶性融合蛋白的產(chǎn)量測(cè)定:取上一步驟中的洗脫液用大分子脫鹽試劑盒進(jìn)行脫鹽,用BCA法測(cè)定其中融合蛋白Trx-T4 DL濃度。

1.2.4.6 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 培養(yǎng)條件采用L9(34)正交表進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以溫度、裝瓶量、接種量及pH為研究對(duì)象(表2),在轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)16 h,每個(gè)處理3次重復(fù),以蛋白產(chǎn)量值分析4因素3水平對(duì)重組菌表達(dá)量的影響,以確定最佳的培養(yǎng)條件[12]。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 The orthogonal experiment factor level table

1.2.5 鎳柱和 MagNi 磁珠純化效果的比較

1.2.5.1 菌體破碎 將菌液按2‰(V/V)的接種量接種于裝瓶量為50 mL/250 mL、pH7的100 mL含Ampr及 Cmr的ZYP+5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)14 h,離心收集菌體,加入結(jié)合緩沖液,終濃度1 mg/mL的溶菌酶,10 mmol/L PMSF及終濃度為1%的Triton-X 100充分混勻,冰浴30 min,超聲破碎[13],離心收集上清。

1.2.5.2 Ni-NTA親和層析柱純化 用Ni-NTA柱(Novagen)進(jìn)行親和層析純化[14],對(duì)收集的上清進(jìn)行10% SDS-PAGE分析。

1.2.5.3 MagNi磁珠純化 按1.2.3.2中方法進(jìn)行純化,對(duì)收集的沉淀、上清、穿透、洗脫液進(jìn)行10% SDS-PAGE分析。

1.2.6 融合蛋白Trx-T4 DL的濃度檢測(cè) 包埋法對(duì)1.2.5.3中純化的融合蛋白Trx-T4 DL進(jìn)行濃縮,經(jīng)脫鹽柱脫鹽以除去咪唑,用BCA法測(cè)定其濃度,加入貯存緩沖液,-20 ℃保存。

1.2.7 融合蛋白Trx-T4 DL的活性檢測(cè) 依照周李華等[15]采取的方法進(jìn)行活性測(cè)定。按表3配置連接反應(yīng)體系,反應(yīng)體系中以ddH2O代替T4 DL設(shè)為空白對(duì)照,以T4 DL作對(duì)照。輕輕混勻,16 ℃水浴30 min,反應(yīng)結(jié)束后65 ℃水浴10 min,置于冰上2 min。電泳檢測(cè)連接情況,按連接情況加入酶的最小體積乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算酶活力。

表3 酶活力測(cè)定的反應(yīng)體系Table 3 The reaction system of enzyme activity detection

1.2.8 融合蛋白Trx-T4 DL在低背景重組載體構(gòu)建中的應(yīng)用 以EcoR V酶切的PUC19-ccdB載體和PCR擴(kuò)增的平末端TEV片段為底物,按表4配置連接反應(yīng)體系,25 ℃反應(yīng) 15 min,置冰上 2 min,以PUC19-ccdB質(zhì)粒及不加T4 DL為空白對(duì)照,以傳統(tǒng)連接方法做對(duì)照,熱激轉(zhuǎn)化到E.coliTrans I克隆感受態(tài)中細(xì)胞中,涂布于含Ampr和Kana的SOB固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。按1.2.1中方法鑒定陽(yáng)性克隆,并計(jì)算陽(yáng)性率。

表4 連接反應(yīng)體系Table 4 The ligation reaction system

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次,采用正交助手軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析,應(yīng)用Excel 2013軟件作表,應(yīng)用10% SDS-PAGE及Bandscan軟件分析蛋白表達(dá)量,應(yīng)用Adobe Photoshop CC 2014軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 T4DL基因擴(kuò)增及克隆的檢測(cè)

2.1.1 T4 DL基因的擴(kuò)增 以T4噬菌體基因組為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在約 1464 bp處有一條清晰帶(圖1),與預(yù)期目的片段大小一致。

圖1 PCR擴(kuò)增T4 DL基因Fig.1 PCR Amprlification of T4 DL gene注:M:DNA marker;1:T4 DL基因PCR產(chǎn)物。

2.1.2 菌落PCR 擴(kuò)增出的目的條帶經(jīng)一步法連接到pET-22b(+)表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化到E.coliTrans I中,涂布于含Ampr的LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取7個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在約1600 bp處都有一清晰帶條,與預(yù)期目的片段大小一致(圖2),以空載體為陰性對(duì)照無(wú)目的條帶,說(shuō)明目的條帶成功插入pET-22b(+)表達(dá)載體中。

圖2 菌落PCR鑒定pET-22b(+)-T4 DL重組質(zhì)粒Fig.2 Identification of recombinant plasmidpET-22b(+)-T4 DL by PCR注:M:DNA marker;1～7:重組菌株;8:空載體。

2.1.3 酶切及測(cè)序鑒定 取菌落PCR檢測(cè)成功的菌株進(jìn)行培養(yǎng),按GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit進(jìn)行質(zhì)粒的提取,以重組質(zhì)粒為陰性對(duì)照,對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH I和Not I酶切。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),可看到約1464 bp和約5370 bp兩條條帶(圖3),與預(yù)期大小基本一致。利用NCBI中的BLAST程序,將測(cè)序的結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行比對(duì),相似性達(dá) 98%,目的片段成功插入到載體中。

圖3 酶切鑒定pET-22b(+)-T4 DL重組質(zhì)粒Fig.3 Identification of recombinant plasmidpET-22b(+)-T4 DL by double enzyme digestion.注:M:DNA marker;1:pET-22b(+)-T4 DL重組質(zhì)粒;2:BamH I和Not I酶切pET-22b(+)-T4 DL重組質(zhì)粒。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-22b(+)-T4 DL為模板,擴(kuò)增出的T4 DL基因經(jīng)一步法分別連接BamH I和Not I酶切后的pNBE Ⅰ～Ⅷ表達(dá)載體(圖4),轉(zhuǎn)化到E.coliTrans I中,涂布于含Ampr的LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,每種重組菌挑取4個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)(圖5),1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示,pNBE I～Ⅷ中有目的條帶出現(xiàn),其約 1655 bp,與預(yù)期大小基本一致,說(shuō)明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 酶切鑒定重組表達(dá)載體Fig.4 Identification of the recombinant plasmid by restriction enzyme digestion 注:M:DNA marker;1:PCR 擴(kuò)增的T4 DL基因;2～9:BamH I和Not I酶切的重組質(zhì)粒pNBE I～Ⅷ。

圖5 菌落PCR鑒定重組表達(dá)載體Fig.5 Identification of the recombinant plasmid by PCR注:M:DNA marker;1～4:重組表達(dá)載體pNBE I-T4DL;5～8:重組表達(dá)載體pNBE II-T4DL;9～12:重組表達(dá)載體pNBE IIII-T4DL;13～16:重組表達(dá)載體pNBE IV-T4DL;17～20:重組表達(dá)載體pNBE V-T4DL;21～24:重組表達(dá)載體pNBE VI-T4DL;25～28:重組表達(dá)載體pNBE VII-T4DL;29～32:重組表達(dá)載體pNBE Ⅷ-T4DL。

2.3 重組菌的自誘導(dǎo)表達(dá)

選取檢測(cè)成功的菌株,按GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit進(jìn)行質(zhì)粒提取,轉(zhuǎn)化到E.coliTransetta(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中,篩選菌株進(jìn)行自誘導(dǎo)培養(yǎng),收集菌體,10% SDS-PAGE電泳顯示(圖6),重組菌Transetta(DE3)/pNBE II-T4DL、Transetta(DE3)/pNBE III-T4DL、Transetta(DE3)/pNBE IV-T4DL、Transetta(DE3)/pNBE VI-T4DL、Transetta(DE3)/pNBE VII-T4DL表達(dá)的與預(yù)期蛋白大小相符的融合蛋白,大小分別為77.41、97.81、112.81、89.81、75.11 kDa。

圖6 T4 DL誘導(dǎo)表達(dá)的10% SDS-PAGE分析Fig.6 The 10% SDS-PAGE profile of T4 DL induced expression 注:M.蛋白質(zhì) marker;1:未誘導(dǎo)菌體;2～9:分別為自誘導(dǎo)的表達(dá)載體為pNBE I～Ⅷ的重組菌。

2.4 融合蛋白的可溶性檢測(cè)

對(duì)1.2.3.1 中收集的菌體進(jìn)行磁珠純化檢測(cè),以確定各重組菌表達(dá)可溶性T4 DL的情況,由10% SDS-PAGE電泳顯示(圖7),重組菌Transetta(DE3)/pNBE II-T4 DL、Transetta(DE3)/pNBE III-T4 DL、Transetta(DE3)/pNBE VII-T4DL經(jīng)純化檢測(cè)后在洗脫液中有目的蛋白條帶,說(shuō)明其表達(dá)可溶性融合蛋白,而純化后條帶較為單一的是重組菌Transetta(DE3)/pNBE VII-T4DL,表達(dá)的可溶性融合蛋白Trx-T4 DL較多,大小約70 kDa,與預(yù)期的分子質(zhì)量大小相符。隨后對(duì)該重組菌進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化,以增加其表達(dá)量。

圖7 T4 DL可溶性表達(dá)的10% SDS-PAGE分析Fig.7 The 10% SDS-PAGE profile of T4 DL expressed in a soluble form注:M:蛋白 marker;1,5,9,13,17,21,25,29:分別為含表達(dá)載體pNBE Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的重組菌破碎后沉淀;2,6,10,14,18,22,26,30:分別為含表達(dá)載體pNBE Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的重組菌破碎后上清;3,7,11,15,19,23,27,31:分別為含表達(dá)載體pNBE Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ重組菌破碎后純化的穿透;4,8,12,16,20,24,28,32:分別為含表達(dá)載體pNBE Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ重組菌破碎后純化的洗脫。

2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件 本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)菌體培養(yǎng)影響較大的4個(gè)方面：溫度、接種量、pH、裝瓶量，分別對(duì)其進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，各因素取值及結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，溫度對(duì)菌體濃度、蛋白可溶性表達(dá)量及蛋白產(chǎn)量均有較大影響，對(duì)菌體濃度而言，溫度越高菌體密度越大，說(shuō)明在一定時(shí)間及溫度內(nèi)，菌體生長(zhǎng)速度越快，整體呈上升趨勢(shì)；對(duì)蛋白可溶性表達(dá)量而言，隨著溫度升高蛋白可溶性表達(dá)量和蛋白產(chǎn)量均先升高后降低，溫度為30 ℃時(shí)可溶性表達(dá)量最高，為65.36%，蛋白產(chǎn)量為646.470 mg/L，其原因是溫度越高菌體生長(zhǎng)較快，菌體生長(zhǎng)及表達(dá)越多，目的蛋白表達(dá)速度也過(guò)快，蛋白錯(cuò)誤折疊率隨之增加，形成包涵體增多，進(jìn)而可溶性蛋白減少，進(jìn)而目的蛋白產(chǎn)量減少，但溫度過(guò)低菌體生長(zhǎng)及表達(dá)速度都過(guò)慢，可溶性蛋白減少，說(shuō)明目的蛋白產(chǎn)量受蛋白可溶性表達(dá)量影響較大。

表5 培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Single factor experiments design and results

接種量對(duì)菌體濃度、蛋白可溶性表達(dá)量及蛋白產(chǎn)量均有影響，對(duì)菌體濃度而言，接種量越高菌體生長(zhǎng)速度越快，菌體密度值越大；對(duì)可溶性表達(dá)量而言，接種量越多蛋白可溶性表達(dá)量越多，最適溫度5‰，對(duì)應(yīng)的蛋白可溶性表達(dá)量為56.28%，隨后可溶性表達(dá)量逐漸降低，其原因是接種量過(guò)多菌體生長(zhǎng)及表達(dá)速度過(guò)快，蛋白錯(cuò)誤折疊率增加，形成包涵體增多，進(jìn)而可溶性蛋白減少；對(duì)蛋白產(chǎn)量而言，其最適溫度也為5‰，對(duì)應(yīng)的蛋白產(chǎn)量為548.359 mg/L，其結(jié)果與蛋白可溶性表達(dá)量的一致，說(shuō)明目的蛋白產(chǎn)量受蛋白可溶性表達(dá)量影響較大。

裝瓶量對(duì)菌體濃度、蛋白可溶性表達(dá)量及蛋白產(chǎn)量均有影響。最適瓶裝量為50 mL/250 mL，此時(shí)的菌體密度為3.58，蛋白可溶性表達(dá)量為56.55%，蛋白產(chǎn)量為614.012 mg/L，其原因是瓶裝量越多培養(yǎng)基多，菌體濃度增加，瓶裝量越多菌體生長(zhǎng)及表達(dá)越快，蛋白可溶性表達(dá)量越多，但瓶裝量過(guò)多溶氧量減少，嚴(yán)重影響菌體生長(zhǎng)速度，會(huì)導(dǎo)致目的蛋白錯(cuò)誤折疊率增加，形成的包涵體增加，蛋白可溶性表達(dá)量減少，菌體濃度降低，說(shuō)明目的蛋白產(chǎn)量受菌體濃度及蛋白可溶性表達(dá)量影響。

初始pH對(duì)菌體濃度、蛋白可溶性表達(dá)量及蛋白產(chǎn)量均有影響。對(duì)菌體濃度而言，最適初始pH為6，其菌體密度為2.75，說(shuō)明培養(yǎng)環(huán)境的pH對(duì)菌體的生長(zhǎng)起到關(guān)鍵性的作用；對(duì)蛋白可溶性表達(dá)量而言，最適初始pH為7，對(duì)應(yīng)的蛋白可溶性表達(dá)量為53.01%，其原因是過(guò)酸或過(guò)減都影響蛋白穩(wěn)定性，使目的蛋白聚沉形成包涵體；對(duì)蛋白產(chǎn)量而言，最適初始pH為7，對(duì)應(yīng)的蛋白產(chǎn)量為544.247 mg/L，與蛋白可溶性表達(dá)量一致，說(shuō)明目的蛋白產(chǎn)量受蛋白可溶性表達(dá)量影響較大。

通過(guò)上述單因素實(shí)驗(yàn)可知，菌體密度和蛋白可溶性表達(dá)量共同影響著蛋白的最終產(chǎn)量，且優(yōu)化的最終目的是提高蛋白產(chǎn)量，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)以蛋白產(chǎn)量為指標(biāo)，省略菌體密度及蛋白可溶性表達(dá)量的測(cè)定。

2.5.2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件 以溫度、接種量、裝瓶量、pH為研究對(duì)象,以蛋白產(chǎn)量為指標(biāo),進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),確定培養(yǎng)條件的最佳組合,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表6和表7。

表6 L9(34)正交設(shè)計(jì)表及結(jié)果分析Table 6 The L9(34)orthogonal design table and the analysis of results

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test

從直觀分析(表6)可知,RA>RC>RD>RB,表明4 種培養(yǎng)條件對(duì)蛋白產(chǎn)量的影響由大到小依次為:溫度、裝瓶量、pH、接種量。從方差分析(表7)可知,影響目的蛋白產(chǎn)量的各因素顯著性次序?yàn)闇囟?裝瓶量>pH>接種量,其中溫度和瓶裝量均有顯著性影響。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得發(fā)酵培養(yǎng)條件的最佳組合為A2B2C3D2,但在正交設(shè)計(jì)表中并沒(méi)有該組合的實(shí)驗(yàn),為此,我們按此組合補(bǔ)充驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在此條件下,目的蛋白產(chǎn)量達(dá)744.023 mg/L，高于正交試驗(yàn)組合各組結(jié)果。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件:溫度30 ℃、裝瓶量50 mL/250 mL、pH7、接種量2‰。

2.6 鎳柱和MagNi磁珠純化效果的比較

2.6.1 Ni-NTA親和層析柱純化 對(duì)重組菌Transetta(DE3)/pNBE VII-T4DL進(jìn)行破碎,取5 mL裂解后上清液進(jìn)行親和層析純化,10% SDS-PAGE顯示(圖9),純化后的洗脫液有一條清晰條帶,其大小為75.11 kDa,與預(yù)期相同,但并不是單一條帶,純化程度不高,并且穿透及漂洗液中都含有融合蛋白,說(shuō)明結(jié)合不完全,最終獲得的融合蛋白量少。

圖9 Ni-NTA柱純化T4 DL的10% SDS-PAGE分析Fig.9 The 10% SDS-PAGE analysis result of T4 DL purified by Ni-NTA column注:M:蛋白質(zhì) marker;1:純化前重組菌裂解后的沉淀;2:純化前重組菌裂解后的上清;3:穿透液;4～6.洗滌液;7～12:第1次到第6次分批洗脫收集的T4 DL。

2.6.2 MagNi磁珠純化 取5 mL裂解后上清液進(jìn)行親和層析純化,由10% SDS-PAGE顯示(圖10),雖穿透中有少許T4 DL,但漂洗中融合蛋白很少,說(shuō)明結(jié)合較完全,洗脫液僅有一條清晰條帶,其大小為75.11 kDa,與預(yù)期相同,純化程度較高,純化量高,所以采用MagNi磁珠純化T4 DL效果較好。

圖10 MagNi磁珠純化T4 DL的10% SDS-PAGE分析Fig.10 The 10% SDS-PAGE analysis result of T4 DL purified by MagNi magnetic beads注:M:預(yù)染蛋白質(zhì) marker;1:純化前重組菌裂解后的沉淀;2:純化前重組菌裂解后的上清;3:穿透液;4～6.洗滌液;7～12:第1次到第 6次分批洗脫收集的T4 DL。

2.7 融合蛋白Trx-T4 DL的濃度測(cè)定

分別對(duì)2.7中鎳柱和MagNi磁珠純化的融合蛋白Trx-T4 DL進(jìn)行濃縮、脫鹽,采用BCA法測(cè)定其濃度分別為559.29、1700.462 mg/L。

2.8 T4 DNA連接酶酶活力測(cè)定

本文以A公司購(gòu)買的T4 DL作對(duì)照,1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖11),當(dāng)A公司購(gòu)買的T4 DL加入量超過(guò) 0.75 μL時(shí),955 bp和3944 bp片段消失,經(jīng)Hind Ⅲ 酶切底物成功連接,而獲得的T4 DL加入超過(guò) 0.3 μL時(shí),經(jīng) Hind Ⅲ 酶切底物成功連接,以A 公司購(gòu)買的T4 DL作對(duì)照,根據(jù)稀釋倍數(shù)可計(jì)算出酶活力約為500 U/μL。

圖11 T4 DL酶活力測(cè)定的10% SDS-PAGE分析Fig.11 The 10% SDS-PAGE analysis result of the enzyme activity determination of T4 DL注:M:DNA marker,1～10:本實(shí)驗(yàn)獲得的T4 DL各濃度梯度連接情況;11～20:A公司的T4 DL各濃度梯度連接情況。

2.9 融合蛋白T4 DL在低背景重組載體構(gòu)建中的應(yīng)用

由表8可知,含PUC19-ccdB質(zhì)粒的菌體不生長(zhǎng),說(shuō)明ccdB致死基因具有抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,不加T4 DL的反應(yīng)體系沒(méi)有菌體生長(zhǎng),說(shuō)明載體酶切較為完全或自連的空載體會(huì)抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng),說(shuō)明PUC19-ccdB載體可提高陽(yáng)性重組率,從而加速陽(yáng)性克隆篩選進(jìn)程[16-18]。與傳統(tǒng)連接方法相比,陽(yáng)性菌落數(shù)多,陽(yáng)性率可達(dá)96.87%,說(shuō)明該方法連接效率更高。

表8 不同連接方法的比較Table 8 Comparison of different ligation methods

3 結(jié)論與討論

本文構(gòu)建了含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和 MBP融合標(biāo)簽的重組表達(dá)載體,通過(guò)磁珠純化法檢測(cè)可溶性表達(dá)情況,篩選出高效表達(dá)的重組菌Transetta(DE3)(pNBEVII-T4 DL),并采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件,通過(guò)方差分析法確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件:溫度30 ℃、裝瓶量50 mL/250 mL、pH7、接種量2‰,比優(yōu)化前的蛋白產(chǎn)量增加了約100 mg/L。利用MagNi 磁珠純化獲得大量高純度融合蛋白Trx-T4 DL,經(jīng)BCA法檢測(cè)其濃度為1700.462 mg/L,與鎳柱法相比,其濃度提高了約3倍。依照周李華等[15]采取的方法進(jìn)行活性測(cè)定,獲得的融合蛋白Trx-T4 DL的酶活約為500 U/μL。分別利用本實(shí)驗(yàn)的連接方法與傳統(tǒng)連接方法進(jìn)行低背景克隆載體構(gòu)建,陽(yáng)性克隆率高達(dá)96.87%,證明該方法具有高效性。

本文為增加可溶性T4 DL的產(chǎn)量分別通過(guò)增加融合標(biāo)簽、選擇Transetta(DE3)作為宿主菌和優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件,但由于蛋白質(zhì)的種類繁多,理化性質(zhì)各異,目前沒(méi)有一個(gè)可以提高可溶性表達(dá)的通用方法,所以最佳表達(dá)可溶性T4 DL的方法可進(jìn)一步深入研究。通過(guò)上述可知,高溫與瓶裝量對(duì)重組菌體Transetta(DE3)(pNBEVII-T4 DL)的可溶性表達(dá)影響較為顯著,因此,我們可降低適當(dāng)培養(yǎng)溫度,減少瓶裝量以增加蛋白產(chǎn)量。目的蛋白只有正確折疊能可溶性表達(dá),這也與溶氧量有關(guān),在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以討論溶氧量與目的蛋白產(chǎn)量的相關(guān)性,可以通過(guò)控制通氧速率來(lái)恒定溶氧量,以提高目的蛋白產(chǎn)量。

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