張增榮 ，蔣小松 ，楊朝武 ，李晴云 ，邱莫寒 ，杜華銳 *

（1.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；2.四川大恒家禽育種有限公司，四川 成都 610066；3.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066）

鈣蛋白酶Ⅰ（CAPN1）廣泛存在于機體各組織，CAPN1是細胞質(zhì)中主要的蛋白水解酶，肌肉增長和宰后嫩度的變化與蛋白質(zhì)水解程度密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶系統(tǒng)在肉的嫩化和改善肉質(zhì)中起著重要作用[2]。Pringle T.D.等[3]研究發(fā)現(xiàn)，CAPN1 活性與牛肉嫩度相關(guān)。White S.N.等[4]在牛上已發(fā)現(xiàn)了與嫩度相關(guān)的多態(tài)性位點。隨著對優(yōu)質(zhì)肉雞的選育，雞肉嫩度有下降的趨勢，而利用分子標記輔助選擇將有可能成為現(xiàn)代育種的有力手段。本研究以雞CAPN1基因為影響肉質(zhì)的候選基因，利用測序和單鏈構(gòu)象多態(tài)（SSCP）方法對雞CAPN1基因外顯子10進行SNPs檢測，分析金陽絲毛雞的基因型頻率及其不同基因型與生產(chǎn)性能的相關(guān)關(guān)系，目的在于尋找與嫩度高度相關(guān)的遺傳標記，為金陽絲毛雞的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 金陽縣畜牧局提供的金陽絲毛雞，公母各半，共計116只。120日齡時采集血液樣品，用酚-氯仿法抽提DNA，然后用TE溶液處理后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同時全部屠宰，進行肉質(zhì)性狀測定。

1.2 主要試劑 引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成；2×Taq PCR MasterMix購自北京天為時代公司。

1.3 引物設(shè)計和PCR擴增 根據(jù)CAPN1的DNA序列（GenBank登錄號：NC_006090.1），設(shè)計雞 CAPN1基因特異性引物。引物序列為：

PCR擴增總體積為 10 μL，PCR擴增體系的組成：5μL 2×Taq PCR MasterMix，3.6μL ddH2O，上下游引物（10 pmol/μL）各 0.3 μL，0.8 μL 模板 DNA（50ng/μL）。PCR擴增程序：94℃預變性 6min；94℃45s，56℃ 45s，72℃ 1min，35 個循環(huán)；最后 72℃繼續(xù)延伸8min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 SSCP分析 2μL PCR產(chǎn)物和0.8μL 6×loading buffer混合，并離心，98℃變性10min，迅速插入冰中，使之保持變性狀態(tài)。采用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr:Bis=29:1）電泳。10V/cm電泳10～11h后，銀染顯色。

1.5 測序 經(jīng)SSCP分析后，取2個不同基因型純合個體的PCR擴增產(chǎn)物在上海英駿生物技術(shù)有限公司進行純化和測序。

1.6 統(tǒng)計分析 計算各種基因型個體在不同品系的分布，用GLM程序進行基因型與肉質(zhì)性狀的最小二乘分析，統(tǒng)計軟件用SAS8.1。其基因型效應(yīng)統(tǒng)計分析模型為：Y=μ+B+S+G+（S×G）+e。其中，Y 為個體肉質(zhì)性狀的觀測值，μ為肉質(zhì)性狀的群體均值，B為品系效應(yīng)，S為性別效應(yīng)，G為基因型值效應(yīng)，S×G為性別與基因型的交互作用，e為隨機參差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 SSCP檢測結(jié)果 對G5432A位點的PCR產(chǎn)物進行SSCP分析，結(jié)果G5432A位點表現(xiàn)出3種基因型：GA、GG、AA。

2.2 不同基因型純合子個體的測序 各取純合基因型的片斷進行回收，并測序，結(jié)果表明：5432位由G→A。G5432A位點GG型的基因序列與GenBank（登錄號：NC_006090.1）中的一致，定義為野生型；AA型都定義為突變型；同時該位點的突變都是錯義突變，造成Ala突變?yōu)門hr。

2.3 金陽絲毛雞基因型和基因頻率統(tǒng)計結(jié)果 對金陽絲毛雞進行基因型檢測，計算該基因的基因型頻率和基因頻率?；蛐秃突蝾l率統(tǒng)計結(jié)果見表1。分析結(jié)果顯示：AA基因型高于GG基因型，A等位基因頻率也明顯高于G等位基因。X2適合性檢驗表明：G5432A位點在金陽絲毛雞中未達到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

表1 G5432A位點的基因型和基因頻率統(tǒng)計

2.4 各種基因型與生產(chǎn)性狀的相關(guān)研究 采用SAS8.1統(tǒng)計軟件，對肉雞CAPN1基因G5432A位點的3種基因型個體的生產(chǎn)性狀進行最小二乘分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G5432A位點的3種基因型個體對部分性狀有顯著影響（P＜0.05），詳見表2。GG型個體的活體重、屠體重、初水分、干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、pH值和肌纖維直徑均顯著高于GA和AA基因型；AA型個體的肌苷酸含量顯著高于GA基因型；AA型個體的肌纖維密度顯著高于GG基因型。

表2 CAPN1基因G5432A位點不同基因型對肉質(zhì)性狀的影響

3 討論

3.1 CAPN1基因單堿基突變情況 本試驗發(fā)現(xiàn)雞CAPN1基因的第10外顯子有一個SNPs位點在8個品系中均具有多態(tài)性，并且A等位基因頻率為優(yōu)勢等位基因。這個基因位點是錯義突變，可能影響轉(zhuǎn)錄本空間（二級）結(jié)構(gòu)，以致影響翻譯效率，導致蛋白水平改變。經(jīng)過X2適合性檢驗，該位點G5432A在金陽絲毛雞中未達到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

3.2 CAPN1基因與肌纖維和屠體性狀的遺傳效應(yīng)分析 候選基因法是尋找畜禽QTL的一種非常有效的方法，它可以直接研究具有特定功能基因的多態(tài)性與經(jīng)濟性狀之間的關(guān)系。從本研究結(jié)果分析得出，可以將A等位基因作為分子標記用于雞肉嫩度的輔助選擇。

4 結(jié)論

CAPN1基因外顯子10內(nèi)的單核苷酸變異會影響肌肉的肌纖維密度、直徑、部分屠體重和肉質(zhì)性狀，可以用這個多態(tài)性位點對雞的嫩度進行分子標記輔助選擇。CAPN1基因可能是影響雞肉嫩度的主效基因或與控制這些性狀的主效基因連鎖。由于本試驗所采的樣本數(shù)量有限，所以還需要進一步的研究驗證，也可以采取其他方法進行研究論證。

參考文獻：

[1]Hopkins D L，Thompson J M.Inhibition of protease activity Part 1.The effect on tenderness and indicators of proteolysis in ovine muscle[J].Meat Science，2001，59：175-185.

[2]Dorothy E C，George N D.Calcium activated neutral protease（chaplain）system：structure，function，and regulation[J].Physiological Review，1991，71：813-847.

[3]Pringle T D，Sneaky P L，Southern G P，et al.Relationship between skeletal muscle-specific chaplain and tenderness ofconditioned porcine lentissimo muscle[J].Animal Science，1999，77：661-668.

[4]White SN，Casas E，Wheeler TL，et al.A new single nucleotide polymorphism in CAPN1 extends the current tenderness marker test to include cattle of Bos indicus，Bos taurus，and crossbred descent[J].Journal of Animal Science，2005，83（9）：2001-2008.