邢志偉，高艷軍，張建武△，張珣，孫紅梅

肺結(jié)核是經(jīng)過空氣傳播的慢性傳染病，主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起，全世界每年約900萬的肺結(jié)核新發(fā)病例，其中大約有140萬人死亡［1-2］。我國的結(jié)核病疫情仍然處于較高水平［3］，控制形勢依然嚴峻。機體對結(jié)核分枝桿菌的免疫防御主要是細胞介導的免疫應答，其中趨化因子發(fā)揮了多種生物學功能。最近研究表明，趨化因子作為一種早期炎癥介質(zhì)起著重要作用，它決定了宿主接觸病原體后的免疫反應［4］。趨化因子CXCL10與CXCL12可以趨化炎癥細胞，誘導多種細胞釋放炎癥因子，起到促進細胞凋亡及抗病毒、抗腫瘤等作用。趨化因子基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)存在基因多態(tài)性，這些基因的多態(tài)性可能改變趨化因子的表達水平、穩(wěn)定性以及與受體之間的相互作用。因此，趨化因子基因的多態(tài)性與疾病進展的程度有關。實際上感染結(jié)核分枝桿菌的人群中約90%沒有臨床癥狀。有研究表明肺結(jié)核感染存在宿主的遺傳差異，個體遺傳基因多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性有關［5］。本文選取趨化因子CXCL10與CXCL12的基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleo-tide polymorphism，SNP）位點進行研究，探討CXCL10-135G/A和CXCL12-801G/A基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2016年10月—2017年3月在我院結(jié)核內(nèi)科住院的102例初治肺結(jié)核痰涂片陽性患者作為病例組，其中男 59 例，女 43例，年齡 19～60歲，平均（38.2±11.7）歲。肺結(jié)核診斷參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS288-2008），以病原學或組織病理學證實為主，輔助檢查結(jié)核菌素試驗（PPD）陽性，結(jié)合典型的臨床表現(xiàn)和影像學證據(jù)，進行綜合分析作出診斷。收集同期來自我院體檢中心的115例健康體檢者為對照組，其中男68例，女47例，年齡24～61 歲，平均（39.1±10.3）歲。所有研究對象均為漢族，均無合并糖尿病、腫瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染性疾病，如病毒性肝炎、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染等。2組人群年齡（t=0.600）、性別（χ2=0.037）差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。本研究所收集的標本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及志愿者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。引物購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。限制性內(nèi)切酶BstBⅠ和MspⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司。Taq PCR Master Mix體系購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR擴增儀（LightCycler 480Ⅱ，Roche公司）。凝膠圖像處理系統(tǒng)（Tanon-1600，上海天能科技有限公司）。電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠）。Nanodrop核酸分析儀［ND2000，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的抽提 抽取患者及體檢者空腹靜脈血2 mL，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）真空管抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒，操作步驟按說明書進行。4℃冰箱保存提取的DNA，備用。

1.3.2 DNA濃度的測定 取DNA樣品2μL，于Nanodrop核酸分析儀檢測DNA濃度以及260 nm和280 nm處光密度（OD）值，測定濃度均為 40 g/L以上，OD260/OD280在 1.7～1.9樣品即為合格DNA。

1.3.3 PCR反應檢測目的基因 體系包括1μL DNA模板，2μL 10×PCR緩沖液（含Mg2+），0.3μL TaqDNA聚合酶（5 U/μL），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（10 mmol/L），用滅菌雙蒸水補齊，體系總共20μL。CXCL10-135G/A 引物：上游 5′-CCGTTCATGTTTTGGAAAGTGA-3′，下 游 5′-GGGAAGTCCCATGTTGCAGATT-3′。 CXCL12-801G/A 引物：上游 5′-CAGTCAACCTGGGCAAAGCC-3′，下游 5′-AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC-3′。PCR擴增條件：95℃預變性 5 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的酶切反應及電泳 對目的基因PCR擴增后的產(chǎn)物進行酶切反應，體系包括10μL PCR產(chǎn)物，各0.5μL限制性內(nèi)切酶，2μL 10×buffer緩沖液，7.0μL滅菌去離子水，總體系20μL?；靹蚍?7℃水浴12 h，取酶切產(chǎn)物10μL上樣于適量溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠中，在1×Tris-硼酸-EDTA（TBE）電泳緩沖液中，80 V恒壓電泳約40 min，最后在自動凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴增條帶及酶切結(jié)果并記錄。進行成像分析后準確判斷酶切產(chǎn)物大小。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。所得數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較進行2獨立樣本t檢驗；基因型及基因頻率以率表示，組間比較采用χ2檢驗。Hardy-Weinberg平衡定律檢驗各組樣本代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型的遺傳平衡分析 結(jié)果顯示，2組CXCL10-135G/A和CXCL12-801G/A位點基因型符合 Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），病例組和對照組樣本均具有群體代表性，見表1。

Tab.1 The distribution of genotypes in two groups表1 2組基因型分布情況 觀察值（理論值）

2.2 PCR-RFLP分析

2.2.1 CXCL10-135G/A及CXCL12-801G/A的PCR擴增產(chǎn)物酶切片段分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切電泳后，CXCL10-135G/A SNP位點GG基因型顯示為123 bp一條片段，AA基因型顯示為100 bp一條片段，GA基因型顯示為123 bp和100 bp兩條片段，見圖1。CXCL12-801G/A SNP位點GG基因型顯示為202 bp和100 bp兩條片段，AA基因型顯示為302 bp一條片段，GA基因型顯示為302 bp、202 bp和100 bp三條片段，見圖2。

2.2.2 CXCL10和CXCL12基因型及等位基因分析 CXCL10-135G/A多態(tài)性基因型及等位基因的分布頻率在病例組及對照組中差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），病例組G等位基因的分布頻率高于對照組，A等位基因的分布頻率低于對照組，見表2。CXCL12-801G/A多態(tài)性基因型及等位基因在分布頻率在病例組及對照組中差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 3。

Fig.1 Enzyme digestion results of PCR product of CXCL10-135 gene圖1 CXCL10-135基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

Fig.2 Enzyme digestion results of PCR product of CXCL12-801 gene圖2 CXCL12-801基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

Tab.2 Distribution of genotype frequency and allele frequency of CXCL10-135G/A表2 CXCL10-135G/A基因型頻率及等位基因頻率分布例（%）

Tab.3 Distribution of genotype frequency and allele frequency of CXCL12-801G/A表3 CXCL12-801G/A基因型頻率及等位基因頻率分布例（%）

3 討論

3.1 宿主對結(jié)核分枝桿菌的免疫防御 結(jié)核分枝桿菌可能侵入人體全身各器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。結(jié)核分枝桿菌主要通過呼吸道進入肺泡，被中性粒細胞、上皮細胞、肺泡巨噬細胞和樹突狀細胞等吞噬［6］，引起細胞介導的免疫反應。上述這些靶細胞可啟動趨化因子和細胞因子等級聯(lián)反應。趨化因子是一類結(jié)構(gòu)和功能相似的小分子細胞因子，可以特異性結(jié)合靶細胞表面受體，通過G蛋白把信號傳入胞內(nèi)，經(jīng)過下游信號分子轉(zhuǎn)導，從而激活靶細胞，趨化單核巨噬細胞及淋巴細胞等到達炎癥或感染部位，最終發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞運輸和黏附等多種生物學作用。結(jié)核病發(fā)病的宿主遺傳因素和趨化因子的作用密切相關，趨化因子基因多態(tài)性在治療反應、基因調(diào)控和疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用［7］。

3.2 趨化因子CXCL10與肺結(jié)核易感的相關性 趨化因子可以分為 4個亞族——C、CC、CXC和CX3C。CXCL10即γ干擾素（IFN-γ）誘導蛋白10（IP-10），屬于CXC類的趨化因子，由IFN-γ誘導產(chǎn)生，其生物學功能包括募集中性粒細胞，促進多種細胞因子分泌，參與感染性疾病如結(jié)核病、病毒性肝炎及惡性腫瘤等發(fā)病。有資料表明CXCL10參與結(jié)核免疫，用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原肽刺激外周血單個核細胞，細胞培養(yǎng)液上清中IP-10的水平比血漿明顯增加，并且肺結(jié)核組顯著高于潛伏感染組和常見肺病組［8］。還有研究顯示IP-10可能成為活動性肺結(jié)核與潛伏性結(jié)核的鑒別診斷指標［9］。CXCL10基因在病毒性肝炎的免疫反應及呼吸道病原體的固有免疫應答中起著重要作用［10-11］。CXCL10基因啟動子區(qū)存在多態(tài)性位點，可以調(diào)節(jié)基因靶位點與核內(nèi)蛋白的親和力，影響核因子（NF）-κB表達的轉(zhuǎn)錄激活作用，最終調(diào)控該基因的表達及趨化因子的表達水平［12］。本研究采用PCR-RFLP技術(shù)研究趨化因子CXCL10-135G/A位點SNP與肺結(jié)核易感相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組與對照組GG、GA和AA三種基因型分布頻率以及G、A等位基因分布頻率分布差異均有統(tǒng)計學意義，因此，CXCL10啟動子區(qū)的-135G/A多態(tài)性位點可能是影響肺結(jié)核發(fā)病易感性的基因位點，這與Tang等［13］的研究結(jié)果一致。

3.3 趨化因子CXCL12與肺結(jié)核易感的相關性 CXCL12屬于CXC類趨化因子，又稱基質(zhì)細胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF），具有多種生物學功能，可以促進血管生成、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應及淋巴細胞分化發(fā)育等［14-15］。有研究發(fā)現(xiàn)胸腔積液中CXCL12水平升高，可能是診斷結(jié)核性胸膜炎的標志物［16］。CXCL12是一種作用于前B細胞的刺激因子，最初在小鼠骨髓基質(zhì)細胞分泌的細胞因子中被發(fā)現(xiàn)。CXCL12-801G/A是人群遺傳變異中較常見的一個多態(tài)性位點，指CXCL12的基因3′非翻譯區(qū)（UTR）第 801位堿基發(fā)生 G→A的突變。CXCL12-G801A基因突變位于編碼CXCL12β轉(zhuǎn)錄子高度保守的片段，可以通過改變基因的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達而影響CXCL12的表達，該基因G801A位點的多態(tài)性與其他疾病的關系已有報道，如HIV感染及移植排斥反應等［17-18］，但與肺結(jié)核病易感的研究報道較少。本研究應用PCR-RFLP分析趨化因子CXCL12801G/A位點SNP與結(jié)核病易感相關性，結(jié)果顯示CXCL12-801G/A基因位點三種基因型分別為GG、GA和AA，2組基因型及等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義，推測CXCL12-801G/A基因位點多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性可能無關。

綜上，在機體控制結(jié)核分枝桿菌的感染免疫中，趨化因子的基因多態(tài)性參與細胞免疫應答的過程，筆者采用PCR-RFLP技術(shù)證實了趨化因子CXCL10-135G/A基因多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)病可能相關。本實驗病例組和對照組標本均來自于我院，由于肺結(jié)核的發(fā)病不僅有宿主的遺傳因素，還有個體差異、地域、環(huán)境因素等影響，這是本研究的局限之處。因此進一步尋找肺結(jié)核病遺傳易感性基因，進行多位點及多因素結(jié)合分析，對于結(jié)核病的防治和早期診斷具有重要的臨床應用價值。

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