王巧興，吳琦，孫昕，李敏敏，宋麗佳，劉會(huì)金，陳懷永，李紅蔚

葉內(nèi)型肺隔離征（ILS）是一種肺部先天發(fā)育異常性疾病，是由發(fā)育異常的肺葉接受體循環(huán)異常供血形成的［1］。ILS約占先天性肺發(fā)育異常疾病的0.15%～6.40%，常見(jiàn)于青少年，表現(xiàn)為反復(fù)或慢性的肺部感染［2］。由于反復(fù)感染及出血風(fēng)險(xiǎn)使得很多患者選擇外科切除受累肺葉的治療方法，目前尚缺乏有效的內(nèi)科治療方案［3］。盡管ILS的病因仍有爭(zhēng)議，但深入了解肺部?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機(jī)制對(duì)尋找ILS新的治療方案是有益的。氣道上皮由多種細(xì)胞組成，其中包括杯狀細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和基底細(xì)胞；其作為機(jī)體第一道防線(xiàn)阻止病原體入侵［4］。杯狀細(xì)胞可分泌多種黏蛋白，其中最主要的是黏蛋白5AC（MUC5AC）和 MUC5B［5-6］。黏蛋白形成黏液層，構(gòu)成氣道化學(xué)屏障，對(duì)抗病原體入侵。纖毛細(xì)胞通過(guò)擺動(dòng)促進(jìn)黏液層移動(dòng)，以清除氣道中的病原體及顆粒物質(zhì)［7］。基底細(xì)胞可以被角蛋白 5（KRT5）標(biāo)記，當(dāng)這些細(xì)胞受損時(shí)，基底細(xì)胞作為干祖細(xì)胞，增殖分化成相應(yīng)的氣道上皮細(xì)胞以維持氣道結(jié)構(gòu)的完整性［8-11］。因此，基底干細(xì)胞功能受損導(dǎo)致氣道完整性不能得到及時(shí)修復(fù)，可能是機(jī)體呼吸道反復(fù)感染的原因之一。本研究通過(guò)比較ILS患者及健康人氣道杯狀上皮細(xì)胞比例、MUC5AC和MUC5B的分泌及表達(dá)、纖毛細(xì)胞的分布及基底細(xì)胞的增殖情況，探討基底干細(xì)胞增殖能力與ILS發(fā)病的關(guān)系，為ILS治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 研究標(biāo)本 4例健康對(duì)照肺石蠟包埋標(biāo)本（對(duì)照組）來(lái)自美國(guó)Cedar Sinai醫(yī)學(xué)中心，并通過(guò)了該中心機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)（IRB）的批準(zhǔn)（協(xié)議號(hào)：pro00032727）。于2004年6月—2014年5月從天津市海河醫(yī)院收集了4例接受外科切除的ILS的肺組織標(biāo)本（ILS組），通過(guò)了天津市海河醫(yī)院IRB的批準(zhǔn)（協(xié)議號(hào)：2015HHLL02）；所有組織標(biāo)本的采集均經(jīng)患者或家屬同意，并已簽署知情同意書(shū)。4例ILS患者中男3例，女1例，1例為新鮮肺組織，3例為石蠟包埋肺組織，年齡21～28歲，平均25歲。

1.2 主要試劑及儀器 蘇木素-伊紅染液購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PAS染色液購(gòu)自珠海貝索科技有限公司；免疫熒光所需抗體如下：鼠源一抗MUC5AC購(gòu)自Thermo Scientific公司；鼠源一抗乙?；?微管蛋白（ACT）購(gòu)自Sigma公司；兔源一抗KRT5購(gòu)自Covance公司；兔源一抗Ki67購(gòu)自eBioscience公司；驢抗鼠二抗及驢抗兔二抗購(gòu)自Invitrogen公司；固定組織RNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；IQTMSYBR?Green Supermix購(gòu)自Bio-Rad Laboratories 公司；10×PCR buffer（無(wú) MgCl2）、MgCl2購(gòu)自Roche公司；dATP、dGTP、dCTP、dUTP、Hexamers（隨機(jī)引物）、RNA酶抑制劑購(gòu)自Talana公司；逆轉(zhuǎn)錄酶Super ScripⅢ（SSⅢ）購(gòu)自Invitrogen公司；正置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司（型號(hào)SZX7），倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Bio-Rad公司，微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色觀察氣道結(jié)構(gòu)及炎性改變 將2組肺組織塊均切成5μm的薄片，脫蠟后用蘇木素溶液染核5 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，流水沖洗，0.5%水溶性伊紅溶液染色1 min，流水沖洗、脫水、封片；HE染色后在顯微鏡下用cellSens Dimension拍照系統(tǒng)拍攝獲取圖像（×400）。

1.3.2 PAS染色觀察氣道杯狀細(xì)胞的數(shù)量 2組石蠟切片脫蠟后用高碘酸溶液處理10～15 min，蒸餾水沖洗，雪夫試劑10～15 min，流水沖洗，Mayer蘇木精染核3 min，流水沖洗、脫水、封片；PAS染色后用cellSens Dimension拍照系統(tǒng)拍攝獲取圖像（×400）；胞漿紅染、胞核藍(lán)染的細(xì)胞為PAS染色陽(yáng)性；每例患者肺組織標(biāo)本均選取5個(gè)氣道統(tǒng)計(jì)其細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其百分比。

1.3.3 免疫熒光染色觀察含MUC5AC、ACT、KRT5及Ki67的細(xì)胞 用已知的陽(yáng)性染色標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照、標(biāo)本一抗和二抗以PBS代替作為自發(fā)熒光對(duì)照、標(biāo)本不加一抗加二抗作為陰性對(duì)照；2組石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)（檸檬酸抗原修復(fù)法）、PBS泡洗、BSA封閉30 min，加一抗于4℃冰箱過(guò)夜，PBST泡洗，加二抗于室溫孵育90 min，PBS泡洗，DAPI熒光封片劑封片；染色后立即用倒置熒光顯微鏡以適當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)觀察染色標(biāo)本，若標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和陰性對(duì)照無(wú)熒光或有微弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照及待測(cè)標(biāo)本為顯著熒光，則為熒光染色陽(yáng)性；于倒置熒光顯微鏡下用cellSens Dimension拍照系統(tǒng)在同一視野中獲取不同波長(zhǎng)下的圖像（×400），軟件合成后得到最終圖像；每例患者肺組織標(biāo)本均選取5個(gè)氣道統(tǒng)計(jì)其細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其百分比。

1.3.4 Real-time PCR測(cè)定MUC5AC和MUC5B的基因表達(dá)量 將2組石蠟包埋肺組織塊切成15μm厚的切片，棄去表面2～3片接觸空氣的切片不用，參照說(shuō)明書(shū)要求提取RNA，將RNA溶液稀釋到40 g/L，按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中各種溶液用量配好反應(yīng)體系，混勻后于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5μL、MgCl215μL、dNTP-Mix 1μL、Hexamers 1μL、RNA 酶抑制劑 0.5μL、SSⅢ0.625μL、RNA樣品5μL、H2O補(bǔ)足至50μL。反轉(zhuǎn)錄程序：25℃10 min，48℃ 40 min，92℃ 5 min，4℃恒溫保存。按照Real-time PCR反應(yīng)體系中各種溶液用量配制反應(yīng)體系，混勻后置于Real-time PCR儀中反應(yīng)獲得目的基因表達(dá)量；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性 40 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次；72℃延伸7 min。25μL的反應(yīng)體系包含 cDNA 5μL、SYBR Green 12.5μL、上下游引物各0.5 μL、H2O 6.5 μL。引物分別為 β-actin：上游 5′-GGCACCCAGCACAATGAAGATCAA-3′，下游 5′-ACTCGT?CATACTCCTGCTTGCTGA-3′；MUC5AC：上游 5′-TCCG?GCCTCATCTTCTCC-3′，下 游 5′-ACTTGGGCACTGGT?GCTG-3′；MUC5B：上游 5′-CACATCCACCCTTCCAAC-3′，下游 5′-GGCTCATTGTCGTCTCTG-3′。管家基因 β-actin標(biāo)化樣品，結(jié)果數(shù)值以Ct值來(lái)表示。待測(cè)樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量為 2-ΔCt。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，2組比較采用秩和檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組氣道的炎性改變 ILS組切除肺葉均為左肺下葉，且均為降主動(dòng)脈異常供血。其中獲得的1例新鮮肺葉呈深紅色，表面呈現(xiàn)大小不同的囊性病變，在開(kāi)放的囊性病變中可見(jiàn)大量黃色膿液（圖1A）。對(duì)照組肺組織HE染色后未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且小氣道結(jié)構(gòu)正常（圖1B）；而ILS組表現(xiàn)為大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且小氣道結(jié)構(gòu)嚴(yán)重扭曲（圖1B）。

Fig.1 Inflammatory changes of lung lobes in two groups圖1 2組肺葉的炎性改變

2.2 2組氣道上皮的改變 ILS組氣道中PAS染色較對(duì)照組更為密集（圖2A）。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)ILS組氣道中含有較多的 MUC5AC（圖 2B），而且MUC5AC陽(yáng)性細(xì)胞/氣道細(xì)胞百分比也明顯增多，Real-time PCR發(fā)現(xiàn)ILS組MUC5AC和MUC5B mRNA水平也較對(duì)照組升高，見(jiàn)表1。免疫熒光結(jié)果表明ILS組和對(duì)照組的ACT陽(yáng)性細(xì)胞/氣道細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3、表1。

2.3 2組中基底干細(xì)胞的增殖能力比較 在遠(yuǎn)端氣道中，KRT5+細(xì)胞占?xì)獾兰?xì)胞的比例在ILS組和對(duì)照組是相當(dāng)?shù)?，?jiàn)圖4、表1。但是，Ki67+KRT5+細(xì)胞占KRT5+細(xì)胞的比例，ILS組明顯少于對(duì)照組，見(jiàn)表1。

Fig.2 Secretion of mucin in two groups（×400）圖2 2組中黏蛋白的分泌情況（×400）

Fig.3 Changes of ciliated cells in two groups(immunofluorescence staining，×400)圖3 2組中纖毛細(xì)胞改變（免疫熒光染色，×400）

Tab.1 Comparison of expressions of all kinds of cells between two groups表1 2組中各類(lèi)細(xì)胞表達(dá)情況的比較 （n=4）

3 討論

本研究中，ILS肺葉的病理改變顯而易見(jiàn)。主要的病理改變是囊性或?qū)嵭愿淖?，這與以前的報(bào)道是一致的［12］。這種囊性改變可能與異常肺葉的循環(huán)動(dòng)脈供血有關(guān)，因?yàn)檠h(huán)動(dòng)脈的壓力較肺動(dòng)脈壓力高。開(kāi)放的囊性病變中含有大量黃色膿液表明異常肺葉已嚴(yán)重感染，而異常肺葉對(duì)細(xì)菌和其他病原體的易感性可能與其和支氣管樹(shù)相通有關(guān)。

氣道上皮作為第一道防御屏障抵抗病原體入侵，不僅是通過(guò)其物理屏障作用而且具有黏液纖毛系統(tǒng)［13-14］。黏液纖毛清除系統(tǒng)是一個(gè)重要的先天性防御機(jī)制，可以保護(hù)肺組織免受吸入性過(guò)敏原和病原體的侵襲。黏液纖毛功能障礙是人類(lèi)氣道反復(fù)感染的常見(jiàn)特征。黏液纖毛系統(tǒng)包括纖毛、保護(hù)性黏液層和氣道表面液體層，它們一起協(xié)同工作，移除從肺吸入的病原體［15］。ACT是纖毛細(xì)胞的標(biāo)志物，可以特異性地標(biāo)記纖毛細(xì)胞。本研究中，ILS組和對(duì)照組中ACT陽(yáng)性細(xì)胞的百分比無(wú)明顯差異，即纖毛細(xì)胞的數(shù)量相似；由于未檢測(cè)ILS中纖毛擺動(dòng)的頻率是否改變，因此ILS中纖毛細(xì)胞的功能是否發(fā)生改變需要進(jìn)一步研究。MUC5B的缺失會(huì)導(dǎo)致呼吸道中致病微生物的積累，最終導(dǎo)致慢性感染［16］。然而，黏蛋白的過(guò)表達(dá)可能會(huì)減弱黏液纖毛的清除能力，為微生物的生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境，從而導(dǎo)致氣道感染［7，17-18］。本研究中，ILS 的異常肺葉中 MUC5AC和MUC5B表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)，所以ILS患者肺部反復(fù)感染可能與黏蛋白過(guò)表達(dá)有關(guān)。因此，減少黏蛋白的產(chǎn)生可能是治療ILS的新方法。

本研究是對(duì)ILS末端氣道干細(xì)胞行為的初次研究?；准?xì)胞存在于人類(lèi)氣管、支氣管和細(xì)支氣管中。當(dāng)病原體入侵時(shí)，氣道基底干細(xì)胞可以通過(guò)增殖修復(fù)來(lái)保證氣道上皮的完整性［19］。通常，當(dāng)病原體感染引起氣道上皮細(xì)胞損傷時(shí)，基底細(xì)胞增殖并分化成CLUB細(xì)胞和纖毛細(xì)胞來(lái)補(bǔ)足受損的氣道上皮細(xì)胞［10,18］。基底細(xì)胞可以被KRT5特異性標(biāo)記，細(xì)胞的增殖活動(dòng)可以被Ki67特異性標(biāo)記；本研究中，KRT5+細(xì)胞占?xì)獾兰?xì)胞的比例在ILS組和對(duì)照組無(wú)明顯差異，Ki67+KRT5+細(xì)胞占KRT5+細(xì)胞的比例，ILS組明顯少于對(duì)照組；可見(jiàn)ILS組與對(duì)照組相比，基底干細(xì)胞的數(shù)量無(wú)明顯差異，但具有增殖能力的基底干細(xì)胞數(shù)量明顯減少。由此可知，ILS組基底干細(xì)胞的增殖能力受損。因此，ILS患者發(fā)生肺部的反復(fù)感染可能與基底干細(xì)胞增殖能力的受限有關(guān)。

Fig.4 Comparison of the proliferative potential of airway basal stem cells between two groups(immunofluorescence staining，×400)圖4 2組中氣道基底干細(xì)胞的增殖潛能的比較（免疫熒光染色，×400）

病原體感染導(dǎo)致的纖毛細(xì)胞的缺失可以通過(guò)基底細(xì)胞增殖來(lái)補(bǔ)償，以此來(lái)修復(fù)氣道上皮細(xì)胞的完整性［20］。當(dāng)病原體感染時(shí)，基底細(xì)胞還可以通過(guò)氣道上皮細(xì)胞去分化再生［21-22］。本研究中，盡管ILS組基底干細(xì)胞的比例保持不變，但是基底干細(xì)胞的增殖潛能受到了抑制。基底細(xì)胞不能維持上皮細(xì)胞完整性，導(dǎo)致入侵的病原體易通過(guò)氣道上皮屏障引起感染。異常肺葉的血供來(lái)源于主動(dòng)脈而非肺動(dòng)脈［23］，而主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可能與基底干細(xì)胞行為的改變有關(guān)。研究表明，內(nèi)皮基質(zhì)金屬蛋白酶-14對(duì)人類(lèi)基底細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要［24］。因此，需要進(jìn)一步研究?jī)?nèi)皮-基質(zhì)相關(guān)性以揭示ILS的發(fā)病機(jī)制。

總之，黏蛋白的高分泌狀態(tài)和基底干細(xì)胞增殖潛能受限導(dǎo)致ILS中氣道上皮細(xì)胞的防御能力減低可能是導(dǎo)致ILS患者反復(fù)感染的原因。因此，通過(guò)提高氣道上皮的再生來(lái)恢復(fù)氣道的完整性為探索ILS的非外科治療提供了一個(gè)新方向。

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